一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种在聚己帰微孔板上包被核酸的方法。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学的飞速发展W及生物物理技术的大量应用，利用核酸杂交来进行 肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、W及各种基因疾病的检测领域中。现有技术中将捕获 核酸探针包被在微孔板上，进行肿瘤或癌的诊断、病毒、细菌等感染、W及各种基因疾病的 检测。但是现有技术中，核酸探针固定在微孔板上，固定的不牢固，造成检测灵敏度低，孔间 变异大。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种在聚己帰微孔板上包被核酸的方法，使得核酸牢固地包被在聚己 帰微孔板上，检测灵敏度高、孔间差异小。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供的在聚己帰微孔板上包被核酸的方法是该样 实现的：
[0005] -种在聚己帰微孔板上包被核酸的方法，包括步骤：
[000引 （1)核酸活化；
[0007] (2)核酸探针包被聚己帰微孔板；
[0008] (i)lX PBS洗聚己帰微孔板，洗板后加入化e Lys solution溶液200y L，3(TC，赔 育 15h ?17h ;
[0009] (j)甩出聚己帰微孔板中化ly Phe Lys液体，IX PBS洗板；
[0010] 化）加入稀释的核酸溶液，2°C -8°C赔育1化?17h ;
[0011] (0)拍出聚己帰微孔板中液体，IX PBS洗板；
[0012] (P)加入膜再生液250 y L，室温赔育化-2h ;
[001引 （q)拍出聚己帰微孔板中液体，IX PBS洗板；
[0014] (r)加入偶联剂 100 y L。2°C -8°C赔育 15h-17h ;
[00巧](S)拍出聚己帰微孔板中液体，IX PBS洗板。
[0016] 可选的，所述步骤（1)包括；（a)解冻BS3;
[0017] 化）平衡PD-10柱子；
[0018] (C)计算活化核酸体积；
[0019] (d)在所述核酸中添加磯酸盐缓冲液；
[0020] (e)在添加了磯酸盐缓冲液核酸溶液中添加所述步骤a中解冻的BS3,室温摇匀 25 ?35min ;
[0021] (f)将步骤（e)中反应液加载到PD-10柱子，用洗脱液洗脱，收集洗脱下的洗脱成 分；
[0022] (g)将所述洗脱成分进行0D260验证；
[0023] 化）含有95%核酸的洗脱成分合并起来，取9.511111〇16853活化并纯化的核酸加入 到包被液中稀释。
[0024] 可选的，所述步骤h取9. 5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包被液中稀释的浓 度：95nmole/L。
[00巧]可选的，包括步骤；所述步骤（2)还包括；（t)使用IX PBS洗板洗板后，将聚己帰 微孔板在温度22C ±3°C、湿度《15%环境下干燥化-311。
[002引可选的，所述膜再生液为；d地20 ;280血、氨氧化轴：2. 25g、SDS:0. 28g、混合摇匀 15?60min制成。
[0027] 可选的，所述偶联剂为；1M Na&PC^O. 918血和1M化2册〇4:9. 882mL用d地20调节 体积至120血并混匀；使用前加入BS3,混匀5min后使用。
[0028] 本发明提供的在聚己帰微孔板上包被核酸的方法，核酸包被牢固，检测灵敏度高。 相对于现有聚己帰微孔板包被技术，包被的核酸探针，是采用生物素和亲和素包被。本发明 聚己帰微孔板底的包被探针是5'端由氨基修饰的探针序列，经过BS 3活化后，与聚苯丙赖 氨酸溶液（Poly Phe Lys solution)氨基化的包被板发生氨基脱水缩合反应，包被探针会 被牢固的交联在板底上。与生物素和亲和素包被技术相比，因不需要蛋白纯化，成本低。
【附图说明】
[0029] 图1是使用生物素包被的聚己帰微孔板探针稀释不同浓度的光子数折线图；
[0030] 图2是本发明使用氨基脱水缩合包被的聚己帰微孔板探针稀释不同浓度的光子 数折线图。
【具体实施方式】
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下实施例，对本发明进行 进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定 本发明。
[0032] -种在聚己帰微孔板上包被核酸的方法，包括步骤：
[003引（1)核酸活化；
[0034] 步骤（一）包括；（a)解冻BS3;
[003引 BS3使用前20min-化，从冰箱中取出，干燥器室温下解冻。
[0036] 化）平衡PD-10柱子；
[0037] 用合适的容器支撑柱子，用25mL洗脱液平衡胶床。
[0038] (C)计算活化核酸体积；
[0039] 计算核酸活化所需最小体积，10块板需12. 7nmol核酸。
[0040] (d)在所述核酸中添加磯酸盐缓冲液；
[0041] 添加1M磯酸盐缓冲液体积为核酸体积的1/10。
[0042] (e)在添加了磯酸盐缓冲液核酸溶液中添加所述步骤a中解冻的BS3,室温摇匀 25 ?35min ;
[0043] 添加 BS32. Omg。
[0044] (f)将步骤（e)中反应液加载到PD-10柱子，用洗脱液洗脱，收集洗脱下的洗脱成 分；
[0045] 洗脱液体积为0. 5血。
[0046] (g)将所述洗脱成分进行0D260验证；
[0047] I.每次洗脱成分，4yL+96uL d地20,颠倒混匀，瞬时离也；ii.d地20做空白检测 0D260 ;III.记录0D260及0D260/0D280。计算每次洗脱成分的0D260浓度、稀释倍数及总 的DNA量。
[0048] 化）含有95%核酸的洗脱成分合并起来，取9.511111〇16853活化并纯化的核酸加入 到包被液中稀释，稀释浓度为95nmole/L。
[0049] (2)核酸探针包被聚己帰微孔板；
[0050] (i) IX PBS洗聚己帰微孔板，洗板后加入化e Lys solution溶液180?220 uL， 25 ?35°C，赔育 15h ?17h ;
[0051] (j)甩出聚己帰微孔板中化ly Phe Lys液体，IX PBS洗板；
[00閲 似加入稀释的核酸溶液，2°C -8°c赔育1化?17h ;
[005引加入80?120 y LBS3活化的核酸溶液。
[0054] (0)拍出聚己帰微孔板中液体，IX PBS洗板；
[00巧](P)加入膜再生液200?300 y L，室温赔育比-2h ;
[0056] 膜再生液为；d地20 ;280血、氨氧化轴：2. 25g、SDS:0. 28g、混合摇匀15-60min制 成。上述配方只是提供一种方案，根据该配方同等比例增加或减少组分的量，都在本申请提 供配方技术方案中。
[0057] (q)拍出聚己帰微孔板中液体，IX PBS洗板；
[005引（r)加入偶联剂 lOOy L，2°C -8°C赔育 15h-17h ;
[0059] 偶联剂为；IM Na&PC^O. 918血和IM化2册〇4:9. 882mL用d地20调节体积至120mL 并混匀；使用前加入BSV混匀5min后使用。上述配方只是提供一种方案，根据该配方同等 比例增加或减少组分的量，都在本申请提供配方技术方案中。
[0060] (S)拍出聚己帰微孔板中液体，IX PBS洗板；
[006。 （t)使用IX PBS洗板后，将聚己帰微孔板在温度22C ±3°C、湿度《15%环境下 干燥化-化。
[0062] 如下本发明使用氨基脱水缩合包被的聚己帰微孔板和现有技术使用生物素包被的聚 己帰微孔板检测HPV E6/E7mRNA为例，检测步骤如下，检测结果如表一、表二和图1、图2所示。
[0063] 1)标本处理；将标本（宫颈上皮脱落细胞）转移至离也管，300化pm离也5分钟 后去上清；加入2mL去离子水，离也去上清；将裂解液lOOul与去离子水200ul、5ul蛋白酶 K(20mg/ml)加入，吹打、混匀，放置65°C恒温箱赔育一小时；一小时后取出，将标本恢复至 室温，取上清液用于检测。
[0064] 裂解液配制各组分的终浓度为：
[0065] a. H巧es 轴盐；13. Omg/ml ;
[0066] b. Hepes 游离酸；11. 92mg/ml ;
[0067] c.氯化裡；50. 88mg/ml ;
[006引 d.己二胺四己酸；3. Omg/ml ;
[0069] e.十二焼基硫酸裡；60. Omg/ml ;
[0070] f. ProclinSOO ：0. 2ul/ml〇
[0071] 2)配置检测混合液
[0072] 表一检测混合液配置（uL/每孔）
[0073]
【主权项】
1. 一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 核酸活化； (2) 核酸探针包被聚乙烯微孔板； (i) IX PBS洗聚乙烯微孔板，洗板后加入Phe Lys solution溶液180?220 μ L，25? 35°C，孵育 15h ?17h ; (j) 甩出聚乙烯微孔板中Poly Phe Lys液体，IX PBS洗板； (k) 加入稀释的核酸溶液，2°C _8°C孵育15h?17h ; (〇)拍出聚乙烯微孔板中液体，IX PBS洗板； (P)加入膜再生液200?300 μ L，室温孵育lh-2h ; (q) 拍出聚乙烯微孔板中液体，IX PBS洗板； (r) 加入偶联剂 80 ?120μ L，2°C _8°C孵育 15h-17h ; (s) 拍出聚乙烯微孔板中液体，IX PBS洗板。
2. 根据权利要求1所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述步骤（1) 包括：（a)解冻BS3; (b) 平衡ro-io柱子； (c) 计算活化核酸体积； (d) 在所述核酸中添加磷酸盐缓冲液； (e) 在添加了磷酸盐缓冲液核酸溶液中添加所述步骤a中解冻的BS3,室温摇匀25? 35min ； (f) 将步骤（e)中反应液加载到ro-io柱子，用洗脱液洗脱，收集洗脱下的洗脱成分； (g) 将所述洗脱成分进行0D260验证； (h) 含有95%核酸的洗脱成分合并起来，取9. 5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包 被液中稀释。
3. 根据权利要求2所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述步骤h取 9. 5nmoleBS3活化并纯化的核酸加入到包被液中稀释的浓度：95nm〇le/L。
4. 根据权利要求1所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，包括步骤：所 述步骤（2)还包括：（t)使用IX PBS洗板洗板后，将聚乙烯微孔板在温度22°C ±3°C、湿度 < 15%环境下干燥2h_3h。
5. 根据权利要求1?4所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述膜再 生液为：ddH20 :280mL、氢氧化钠：2. 25g、SDS:0. 28g、混合摇匀15-60min制成。
6. 根据权利要求1?4所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，根据 权利要求1?4所述的聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，其特征在于，所述偶联剂为：IM NaH 2PO4 = O. 918mL和IM Na2HP04:9 . 88 2mL用ddH20调节体积至120mL并混匀；使用前加入 BS3,混勻5min后使用。
【专利摘要】本发明提供一种在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，包括步骤：(1)核酸活化；(2)碳酸探针包被聚乙烯微孔板；(i)1X？PBS洗聚乙烯微孔板，洗板后加入Phe？Lys？solution溶液200μL，30℃，孵育15h～17h；(j)甩出聚乙烯微孔板中Poly？Phe？Lys液体，1X？PBS洗板；(k)加入稀释的核酸溶液，2℃-8℃孵育15h～17h；(o)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X？PBS洗板；(p)加入膜再生液250μL，室温孵育1h-2h；(q)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X？PBS洗板；(r)加入偶联剂100μL，2℃-8℃孵育15h-17h；(s)拍出聚乙烯微孔板中液体，1X？PBS洗板；本发明的在聚乙烯微孔板上包被核酸的方法，使得核酸牢固地包被在聚乙烯微孔板上，检测灵敏度高。
【IPC分类】G01N33-545
【公开号】CN104569383
【申请号】CN201510015018
【发明人】张鹭鹭, 李先坤, 程昀静, 李小磊
【申请人】科蒂亚(新乡)生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月13日