一种罗非鱼源无乳链球菌elisa快速检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无乳链球菌早期快速检测技术，尤其是一种罗非鱼源无乳链球菌 ELISA快速检测试剂盒及其检测方法，属于检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌（Streptococ州S agalactiae)又名 B 族链球菌（Group B Streptococcus,GB巧，革兰氏阳性球菌，是自然界中广泛存在的一种条件致病菌。罗非鱼是 我国出口量最大的养殖鱼类，曾经W易养抗病力强著称，但2009年在我国海南省首次大规 模爆发无乳链球菌病后，已成为危害我国罗非鱼产业最严重的病原菌。从生产角度，该病面 临表现症状复杂化，发病快，死亡率高等特点，给防治技术的研究和应用带来了困难，也是 目前尚无有效手段控制的症结之一。因此，建立简便，稳定的无乳链球菌快速检测技术，尤 其是早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。PCR检测方法（双重PCR，H重PCR，巢式 PCR)灵敏度高，但受实验条件、费用高、假阳性率高点等因素的限制，不宜推广。相比之下 ELISA方法操作简单易行，无需特殊仪器，更适合基层单位进行罗非鱼无乳链球菌病原菌的 筛查。郭玉娟（2012年）和霍欢欢（2013年）的研究表明，我国罗非鱼源无乳链球菌的分 子血清型均为la型，说明不同年份和不同地区的罗非鱼源无乳链球菌在血清型上未发生 明显的变异，为无乳链球菌化ISA快速检测试剂盒的研制和临床适用提供了基础保障。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种罗非鱼源无乳链球菌 ELISA快速检测试剂盒及其检测方法，能实现对罗非鱼源无乳链球菌高通量快速检测。
[0004] 按照本发明提供的技术方案，一种罗非鱼源无乳链球菌化ISA快速检测试剂盒， 包括酶标板，包被缓冲液、BSA封闭液、PBST洗涂缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、稀 释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；
[0005] 包被抗原为用包被缓冲液稀释的浓度为106?10 8c化/mL的病原菌液；
[0006] 所述快速检测试剂盒的检测方法是将W经分离并培养得到的病原菌液为作为包 被抗原；阳性判断标准如下；（被检样品〇〇4。。值一空白对照0D 45。值）/ (阴性对照样品0D 4W 值一空白对照〇〇4日。值）> 2. 1。
[0007] 所述包被缓冲液为0. 05M碳酸盐缓冲液，pH为9. 6 ;其组份为Na2C〇3 1. 59g， NaHCOgS. 93g,无菌水定容至1000mL，4°C保存不超过1周。
[0008] 所述PBST洗涂缓冲液为含吐温-20的0. 15M PBS，其组份为：化C1 8. Og ; 化2册〇4. 12&0 2. 9g ;KC1 0. 2g ;皿2口〇4 0. 24g ;吐温-200. 5mL 化0 lOOOmL。
[0009] 所述的BSA封闭液为0.25%?1 %的牛血清蛋白溶液，其组份为；0.25g?Ig的 牛血清蛋白、100血的PBST洗涂缓冲液。
[0010] 所述的一抗阳性血清是W罗非鱼源无乳链球菌LB110808-2为抗原，免疫兔子获 得效价达1:2560 W上的多克隆抗体；未进行免疫的兔血清作为阴性对照血清。
[0011] 所述的酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP酶标抗体。
[001引所述的稀释液为0. 1 %的牛血清蛋白溶液，其组份为0. Ig的牛血清蛋白、100血的 PBST洗涂缓冲液。
[0013] 所述的底物显色液为可溶型单组分TMB (即四甲基联苯胺）底物溶液，其组分为 TMB (2mg/mL无水己醇）0. 5血，底物缓冲液10血，0. 75 % &化32. 0 y L ;所述的底物缓冲液配 制方法为0. 2M化2册〇4 25. 7血，0. 1M巧樣酸24. 3血，d地2〇定容至50血。
[0014] 所述的终止液为2M H2SO4。
[001引所述罗非鱼源无乳链球菌化ISA快速检测试剂盒的检测方法，步骤为：
[0016] (1)抗原包被：用pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释病原菌，每种病原菌分别设阴性对照 孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内分别加入50?150 y L的1〇6?10 8 C化/ 血浓度的病原菌，空白对照孔加入50?150 y L的包被缓冲液，6(TC烘箱内4?12小时烘 干；
[0017] 似洗板海个酶标板孔内加入200?300 y L PBST洗涂缓冲液，静置1?5分钟， 甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3?5次；
[001引 （3)封闭；每个酶标板孔内加入100?300y L 0. 25%?1%的BSA封闭液，封闭 60?120分钟；空白对照孔不加任何试剂；
[0019] (4)洗板；每个酶标板孔内加入200?300 y Ly L PBST洗涂液，静置1?5分钟， 甩去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3?5次；
[0020] (5)加一抗阳性血清；一抗阳性血清用稀释液稀释5000?30000倍后，每孔 100 y L，37°C赔育60?90min ;被检样品孔加一抗阳性血清，阴性对照孔加阴性对照血清， 空白对照孔不加任何试剂；
[0021] (6)洗板；每个酶标板孔内加入200?300 y L PBST洗涂液，静置1?5分钟，甩 去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3?5次；
[002引 （7)加酶标二抗；每孔加入工作浓度1000?2000倍稀释的50?150 y L的羊抗 兔IgG-HRP酶标抗体，37°C赔育60?90min ;
[0023] (8)洗板；每个酶标板孔内加入200?300 y L PBST洗涂液，静置1?5分钟，甩 去洗液，在吸水纸上尽量拍干，重复3?5次；
[0024] (9)加底物：每孔加入可溶型单组分TMB底物溶液50?150iiL，37°C避光反应 15 ?20min ;
[002引 （10)终止反应海孔加入终止液50 y L ;
[002引 （11)读数；在酶标仪450皿下读数；
[0027] (。）结果的判断：
[0028] a、肉眼观察：与阴性对照孔进行比较，若被检样品孔中现黄色，则被检样品孔为阳 性；若被检样品孔与阴性对照孔一样为无色，则被检样品孔为阴性；
[0029] b、酶标仪检测；（被检样品0〇45。值一空白对照0D 45。值）/ (阴性对照样品0D 45。值一 空白对照〇〇45。值）> 2. 1，被检样品孔为阳性，反之则为阴性。
[0030] 本发明的有益效果；本发明所建立的检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性 好及方便快捷和使用范围广的优点。本发明可在96孔酶标板中进行，样品检测成本远低于 传统的仪器检测方法，适用于基层单位对罗非鱼源无乳链球菌的临床大规模检测和流行病 学调查。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0032] 实施例1 一种罗非鱼源无乳链球菌ELISA快速检巧IJ试剂盒
[0033] 所述的试剂盒包含酶标板，包被缓冲液、封闭液、PBST洗涂缓冲液、一抗阳性血清、 阴性对照血清、稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液，其中，所用的包被抗原为用包被缓 冲液稀释的浓度为l〇 6c化/mL的病原菌液。
[0034] 该间接化ISA方法是将W经分离并培养得到的病原菌液为作为包被抗原；而且阳 性判断标准如下：（被检样品〇〇45。值一空白对照〇〇45。值）/(阴性对照样品〇〇45。值一空白 对照〇〇4日0值）> 2. 1。
[0035] 所述包被缓冲液为0. 05M碳酸盐缓冲液，pH为9. 6,其组份为NasCOjl. 59g， NaHOy. 93g，无菌水定容至1000mL，4°C保存不超过1周。
[0036] 所述PBST洗涂缓冲液为含吐温20的0. 15M PBS，其组份为；NaCl 8. Og ; 化2册〇4. 12&0 2. 9g ;KC1 0. 2g ;皿2口〇4 0. 24g ;吐温-20 0. 5血化0 1000血。
[0037] 所述的封闭液为0. 25%?1 %的牛血清蛋白溶液，其组份为；0. 25g?Ig的牛血 清蛋白、100血的PBST洗涂缓冲液。
[0038] 所述的一抗血清是W罗非鱼源无乳链球菌LB110808-2为抗原，免疫兔子获得效 价达1:2560 W上的多克隆抗体；未进行免疫的兔血清作为阴性对照血清。
[0039] 所述的酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP酶标抗体。
[0040] 所述的稀释液为0. 1%的牛血清蛋白溶液，其组份为；0. Ig的牛血清蛋白、100血 的PBST洗涂缓冲液。
[0041] 所述的底物显色液为可溶型单组分TMB(即四甲基联苯胺）底物溶液，其组分为 TMB (2mg/血无水己醇）0. 5血，底物缓冲液10血，0. 75 % &化32. 0 y L ;所述的底物缓冲液配 制方法为0. 2M化2册〇4 25. 7血，0. 1M巧樣酸24. 3血，d地2〇定容至50血。
[0042] 所述的终止液为2M恥〇4。
[0043] 所述的试剂盒采用从罗非鱼上分离并培养得到的病原菌作为分析样品，其特征 是，包括W下步骤：
[0044] (1)抗原包被：用PH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释病原菌，每种病原菌分别设阴性对照 孔和空白对照孔，每个被检样品孔和阴性对照孔内分别加入lOOy L的l〇6c化/mL浓度的病 原菌，空白对照孔加入100 y L的包被缓