胶体金层析法检测雌酮硫酸钠的试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物医学免疫检测技术领域，是一种胶体金层析法检测雌酮硫酸钠的试纸条。
【背景技术】
[0002]根据文献报道雌激素替代疗法范围越来越广泛。由于生理和病理原因引起的雌激素分泌不足而导致的各种患者呈不断增长态势。目前获取制备雌激素类药物原料的一个主要方向是从孕马尿中提取天然雌激素。市场需求量的激增，使从孕马尿中提取雌激素的生产规模不断扩大。对孕马尿含量的常规检测分析主要是利用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等仪器在试验室操作，方法繁琐、分析速度慢、成本高，要求仪器化程度高等；随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率孕马尿中雌激素分析技术。
【发明内容】
[0003]本发明提供了一种胶体金层析法检测雌酮硫酸钠的试纸条，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决孕马尿含量的常规检测方法繁琐、分析速度慢、成本高和仪器化程度高，已不能适应现有技术要求的问题。
[0004]本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种胶体金层析法检测雌酮硫酸钠的试纸条，包括底板、样品吸收垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；在底板的中部顶端固定连接有硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜的中部沿径向分别划有相平行的检测线和质控线，在硝酸纤维素膜的左部上端固定连接有金标抗体结合垫，在金标抗体结合垫的左部上端固定连接有样品吸收垫，在硝酸纤维素膜的右部上端固定连接有吸水滤纸。
[0005]下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进:
上述检测线按下述方法得到:第一步，精密称取6.6mg雌酮硫酸钠-17-厢置反应瓶中，在反应瓶中加入ImlN, N-二甲基亚酰胺溶解在雌酮硫酸钠-17-厢中，溶解后加入2.0ml二氧六环混匀，在温度为4°C下放置30min，后加入23.2 μ I三正丁胺并搅拌反应30min，反应后加入17.4 μ I氯甲酸已丁酯混匀后得到活化溶液(A);第二步，精密称取98.5mg牛血清白蛋白，在牛血清白蛋白中依次加入5ml浓度为0.0lmol -L-1、pH为7.4的磷酸盐缓冲液和2ml二氧六环并均匀，在温度为4°C下放置30min后得到溶液(B);第三步，将活化溶液(A)加入溶液(B)中并搅拌均匀，调节pH值为8.0至9，在温度为4°C下继续搅拌反应18h，反应完成后将反应液转移入透析袋，置于温度为4°C下、浓度为0.05 mol *L-1、pH为7.4的碳酸盐缓冲液中透析1h至24h，透析后得到结合比为1:24的人工抗原；第四步，将人工抗原和弗氏完全佐剂等体积乳化后得到初次免疫剂，人工抗原和弗氏不完全佐剂等体积乳化后得到加强免疫剂，选择体重为1.8kg至2.1kg的新西兰白雄兔，对新西兰白雄兔采用背部皮下多点注射法进行一次初次免疫和三次加强免疫，初次免疫用初次免疫剂，初次免疫剂的剂量为0.8mg/只兔，初次免疫后再进行三次加强免疫，加强免疫用加强免疫剂，加强免疫剂的剂量为0.40mg/只兔,每次免疫时间间隔为I周至2周,最后一次免疫完成10天后对新西兰白雄兔采血收集血清，用ELISA法测定抗血清的效价，待抗血清的效价达到1:20000后，采取兔心脏采血法获取全血，全血析出血清后,在血清过蛋白A亲和层析柱纯化后，力口入体积百分比为0.01%的硫柳汞水溶液Iml至3ml混匀后得到抗雌酮硫酸钠特异性抗体；第五步，通过微量进样器在硝酸纤维素膜上用抗雌酮硫酸钠特异性抗体划线包被得到检测线。
[0006]上述检测线的宽度为Imm至1.5mm,检测线的点样量按0.5cm宽的试纸条上点样
1.5ul。
[0007]上述质控线按下述方法得到:通过微量进样器在硝酸纤维素膜上用浓度为
1.0mg/ml的羊抗兔IgG划线包被得到质控线。
[0008]上述将划有检测线和质控线的硝酸纤维素膜用封闭液在37°C下浸泡封闭30分钟后自然风干；其中:封闭液包括磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白和Tween20，磷酸盐缓冲液为浓度为0.0lmol *L-1、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，牛血清白蛋白在封闭液中的质量百分比为1%，Tween20在封闭液中的质量百分比为0.1%。
[0009]上述金标抗体结合垫按下述方法得到:第一步，把氯金酸加入超纯水中配成质量百分比浓度为0.01%的氯金酸水溶液，将氯金酸水溶液煮沸后每10ml加入质量百分比为1%的柠橡酸三钠水溶液3ml，继续煮沸2min，待冷却至室温后用浓度为0.1mol.L-1的K2C03调至PH为8.2后得到胶体金溶液；第二步，在10ml胶体金溶液中加入600 μ g抗雌酮硫酸钠特异性抗体搅拌1min后得到第一混合液，搅拌后在温度为4°C下静置45min，然后加入牛血清白蛋白搅拌1min后得到第二混合液，牛血清白蛋白在第二混合液中的体积百分比浓度为1%，将第二混合液12000rpm离心5min，吸去上清后所得沉淀即为胶体金标记抗雌酮硫酸钠特异性抗体；第三步，按每4mg的胶体金标记抗雌酮硫酸钠特异性抗体中加入Iml的蒸馏水进行稀释，稀释后按30μ l/cm2的量均匀喷涂于玻璃纤维素膜上，在温度为-20°C下、真空度为200Pa下冷冻真空干燥后得到金标抗体结合垫。
[0010]上述硝酸纤维素膜上的抗雌酮硫酸钠特异性抗体的物质的量和金标抗体结合垫上的胶体金标记抗雌酮硫酸钠特异性抗体的物质的量相等。
[0011]本发明结构合理而紧凑，使用方便，通过底板、样品吸收垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸的配合使用，实现快速检测孕马尿的目的，具有快速、灵敏度高、特异性强、使用简便、价格低廉、结果直观、携带方便的特点，不需要专门的测试辅助设备，缩短了测试时间，提高了测试效率，适用于兽医院和养殖场对马妊娠的检测。
【附图说明】
[0012]附图1为本发明实施例1的主视结构示意图。
[0013]附图2为附图1的俯视结构示意图。
[0014]附图中的编码分别为:I为底板，2为样品吸收垫,3为金标抗体结合垫,4为硝酸纤维素膜，5为吸水滤纸，6为检测线，7为质控线。
【具体实施方式】
[0015]本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
[0016]在本发明中，为了便于描述，各部件的相对位置关系的描述均是根据说明书附图1的布图方式来进行描述的，如:前、后、上、下、左、右等的位置关系是依据说明书附图1的布图方向来确定的。
[0017]实施例1，如图1所示，该胶体金层析法检测雌酮硫酸钠的试纸条包括底板1、样品吸收垫2、金标抗体结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水滤纸5;在底板I的中部顶端固定连接有硝酸纤维素膜4，在硝酸纤维素膜4的中部沿径向分别划有相平行的检测线6和质控线7，在硝酸纤维素膜4的左部上端固定连接有金标抗体结合垫3，在金标抗体结合垫3的左部上端固定连接有样品吸收垫2，在硝酸纤维素膜4的右部上端固定连接有吸水滤纸5。底板
1、样品吸收垫2、硝酸纤维素膜4和吸水滤纸5均为现有公知公用的材料。
[0018]实施例2，作为上述实施例的优化，检测线6按下述方法得到:第一步，精密称取6.6mg雌酮硫酸钠-17-厢置反应瓶中，在反应瓶中加入lmlN，N-二甲基亚酰胺溶解在雌酮硫酸钠-17-厢中，溶解后加入2.0ml二氧六环混匀，在温度为4°C下放置30min，后加入23.2 μ I三正丁胺并搅拌反应30min，反应后加入17.4 μ I氯甲酸已丁酯混匀后得到活化溶液(A);第二步，精密称取98.5mg牛血清白蛋白，在牛血清白蛋白中依次加入5ml浓度为0.0lmol.L-1、pH为7.4的磷酸盐缓冲液和2ml二氧六环并均匀，在温度为4°C下放置30min后得到溶液(B);第三步，将活化溶液(A)加入溶液(B)中并搅拌均匀，调节pH值为
8.0至9，在温度为4°C下继续搅拌反应18h，反应完成后将反应液转移入透析袋，置于温度为4°C下、浓度为0.05 mo 1-L-1、pH为7.4的碳酸盐缓冲液中透析1h至24h，透析后得到结合比为1:24的人工抗原；第四步，将人工抗原和弗氏完全佐剂等体积乳化后得到初次免疫剂，人工抗原和弗氏不完全佐剂等体积乳化后得到加强免疫剂，选择体重为1.8kg至
2.1kg的新西兰白雄兔，对新西兰白雄兔采用背部皮下多点注射法进行一次初次免疫和三次加强免疫，初次免疫用初次免疫剂，初次免疫剂的剂量为0.8mg/只兔，初次免疫后再进行三次加强免疫,加强免疫用加强免疫剂,加强免疫剂的剂量为0.40mg/只兔，每次免疫时间间隔为I周至2周，最后一次免疫完成10天后对新西兰白雄兔采血收集血清，用ELISA法测定抗血清的效价，待抗血清的效价达到1:20000后，采取兔心脏采血法获取全血，全血析出血清后，在血清过蛋白A亲和层析柱纯化后，加入体积百分比为0.01%的硫柳汞水溶液Iml至3ml混匀后得到抗雌酮硫酸钠特异性抗体；第五步，通过微量进样器在硝酸纤维素膜4上用抗雌酮硫酸钠特异性抗体划线包被得到检测线6。
[0019]实施例3,作为上述实施例的优化,检测线6的宽度为Imm至1.5mm,检测线6的点样量按0.5cm宽的试纸条上点样1.5 μ I。
[0020]实施例4，作为上述实施例的优化，质控线7按下述方法得到:通过微量进样器在硝酸纤维素膜4上用浓度为1.0mg/ml的羊抗兔IgG划线包被得到质控线7。
[0021]实施例5，作为上述实施例的优化，将划有检测线6和质控线7的硝酸纤维素膜4用封闭液在37°C下浸泡封闭30分钟后自然风干；其中:封闭液包括磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白和TWeen20，磷酸盐缓冲液为浓度为0.0lmol.L-1、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，牛血清白蛋白在封闭液中的质量百分比为1%，Tween20在封闭液中的质量百分比为0.1%。
[0022]实施例6，作为上述实施例的优化，金标抗体结合垫3按下述方法得到:第一步，把氯金酸加入超纯水中配成质量百分比浓度为0.01%的氯金酸水溶液，将氯金酸水溶液煮沸后每10ml加入质量百分比为1%的柠橡酸三钠水溶液3ml，继续煮沸2min，待冷却至室温后用浓度为0.1mol *L-1的K2C03调至PH为8.2后得