一种用于maldi-tof ms检测的植物线虫前处理方法
【技术领域】
[0001]本发明属于质谱分析技术领±或，特别是涉及一种用于MALD1-T0FMS (Matrix-assisted laser desorpt1n/1nizat1n time-of-fIight massspectrometry的缩写，中文全称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)检测的植物线虫前处理方法。
【背景技术】
[0002]MALD1-TOF MS仪器主要由两部分组成:基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测。MALD1-T0F-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段。近年来，该技术逐渐被用于植物细菌、真菌和线虫的检测当中。但检测前对植物线虫的前处理方法很难操作，使得到的结果稳定性差、背景信号多而杂、灵敏度低从而影响对植物线虫的检测。
【发明内容】
[0003]为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种用于MALD1-TOF MS检测的植物线虫前处理方法。
[0004]本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决:
[0005]一种用于MALD1-TOF MS检测的植物线虫前处理方法，包括如下步骤:
[0006](I)在灭菌的载片上滴加提取液，所述提取液的滴加量为每条所述植物线虫滴加5-8 μ I ；
[0007](2)在体视显微镜下将清洗好的所述植物线虫转移到所述载片上的提取液中，并压破所述植物线虫，所述提取液用于提取所述植物线虫的蛋白质并将所述蛋白质降解为多肽；
[0008](3)在体视显微镜下，用移液枪吸取步骤(2)中的提取液并连带压破的植物线虫一起滴加在样品板上，并晾干；
[0009](4)在晾干后的样品板上加基质溶液，使所述多肽分散在所述基质溶液中，并晾干得到用于MALD1-TOF MS检测的样品，每条所述植物线虫加1-1.5 μ I的所述基质溶液。
[0010]优选地，所述提取液选自以下群组中的一种:
[0011]三氟乙酸和灭菌水的混合溶液，在该混合溶液中，三氟乙酸的体积浓度为0.1-0.5%，余量为灭菌水；
[0012]乙醇和灭菌水的混合溶液，在该混合溶液中，乙醇的体积浓度为90-95%，余量为灭菌水；
[0013]丙酮和灭菌水的混合溶液，在该混合溶液中，丙酮的体积浓度为90-95 %，余量为灭菌水；
[0014]甲酸、乙腈和灭菌水的混合溶液，在该混合溶液中所述甲酸的体积浓度为33-37%，所述乙腈的体积浓度是48-52%，余量为灭菌水；
[0015]甲酸、异丙醇和灭菌水的混合溶液，在该混合溶液中所述甲酸的体积浓度为17-22%,所述异丙醇的体积浓度是33-35%，余量为灭菌水。
[0016]优选地，步骤(4)中的所述基质溶液是由以下形成:将适用于多肽的基质加入一溶剂中直到所述基质过饱和。
[0017]进一步优选地，所述基质为α -氰基-4-轻基肉桂酸(α -cyano-4-hydroxycinnamicacid, CHCA)、芥子酸(sinapinic acid)、阿魏酸(Ferulic Acid)、2_ (4-轻基亚胺)苯甲酸(2_ (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid, HABA)、5_ 氯 _2_ 疏基苯丙噻挫(5-chloro_2-mercaptobenzothiazole, CMBT)。
[0018]进一步优选地，所述溶剂选自以下群组中的一种:
[0019]乙腈、三氟乙酸和灭菌水的混合溶剂，在该混合溶剂中乙腈的体积浓度为33-50%，三氟乙酸的体积浓度为2.5-3.3%，余量为灭菌水；
[0020]乙醇和灭菌水的混合溶剂，在该混合溶剂中乙醇的体积浓度为45-55 %，余量为灭菌水；
[0021]甲醇和灭菌水的混合溶剂，在该混合溶剂中甲醇的体积浓度为45-55%，余量为灭菌水；
[0022]乙腈和灭菌水的混合溶剂，在该混合溶剂中乙腈的体积浓度为45-55%，余量为灭菌水；
[0023]四氢呋喃和灭菌水的混合溶剂，在该混合溶剂中四氢呋喃的体积浓度为45-55%，余量为灭菌水；
[0024]丙酮和灭菌水的混合溶剂，在该混合溶剂中丙酮的体积浓度为45-55%，余量为灭菌水。
[0025]样品与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给样品分子，而使样品分子电离，共结晶薄膜的形成是检测的关键。以上挑选的溶解基质的溶剂能保护并促进基质和样品形成共结晶薄膜，利于检测。
[0026]优选地，在所述步骤(I)之前还包括清洗步骤:将所述植物线虫转移到离心管中，加入1-1.2mL灭菌水，祸旋5-8min，4000-5000rpm离心5_10min，去上清液；然后加入1-1.2mL灭菌水，祸旋5_8min，4000-5000rpm离心5-10min，去上清液；再加入1-1.2mL灭菌水，祸旋5_8min，4000-5000rpm离心5_10min，去上清液；最后加1-1.2mL灭菌水，备用。
[0027]本发明与现有技术对比的有益效果是:本发明的植物线虫的前处理方法是针对单条植物线虫进行的处理，将单条植物线虫挑到载片(如载玻片)的提取液中，在体视显微镜下压破线虫，使蛋白质释放到提取液中，在体视显微镜下用移液枪将植物线虫转移到样品板上，然后加基质溶液进行后续检测，该方法易于操作，多次重复测定后得到的结果重复性好，结果稳定；经过处理后的植物线虫用MALD1-TOF MS检测得到的多肽质谱图的背景信号低，由于植物线虫中的蛋白质被提取和水解的比较彻底，使得灵敏度较高，本发明的方法适用MALD1-TOFMS对植物线虫的检疫、检测和鉴定。
【附图说明】
[0028]图1是本发明实施例1中的单条根结线虫的多肽质谱图谱。
【具体实施方式】
[0029]下面对照附图并结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0030]本发明提供一种用于MALD1-TOF MS检测的植物线虫前处理方法，在一种实施方式中，包括如下步骤:
[0031](I)在灭菌的载片上滴加提取液，所述提取液的滴加量为每条所述植物线虫滴加5-8 μ I ；
[0032](2)在体视显微镜下将清洗好的所述植物线虫转移到所述载片上的提取液中，并压破所述植物线虫，所述提取液用于提取所述植物线虫的蛋白质并将所述蛋白质水解为多肽；
[0033](3)在体视显微镜下，用移液枪吸取步骤(2)中的提取液并连带压破的植物线虫一起滴加在样品板上，并晾干；
[0034](4)在晾干后的样品板上加基质溶液，使所述多肽分散在所述基质溶液中，并晾干得到用于MALD1-TOF MS检测的样品，每条所述植物线虫加1-1.5 μ I的所述基质溶液。
[0035]其中:
[0036]提取液具有破壁功能，能促进植物线虫中的蛋白质释放并进一步水解为多肽，每条植物线虫需要的提取液的量为5-8 μ 1，在一些实施例中，可以是5 μ 1、6 μ 1、7 μ 1、8 μ I等等。
[0037]步骤⑷中的基质溶液中的基质是用于MALD1-TOF MS检测的基质，在本实施方式中，选择适用于分散多肽的基质，每条植物线虫加1-1.5μ I的基质溶液，在一些实施例中可以加 1μ1、1.2μ1、1.5μ1 等。
[0038]以下以植物根结线虫为例对本发明进行详细阐述。
[0039]实施例1
[0040]1.根结线虫的清洗
[0041]将从植物中获取的单条的根结线虫