一种同时测定半夏中6种有机酸含量的hplc方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药测定方法，具体涉及一种利用HPLC同时测定半夏中6种有机 酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(thunb. )Breit.的干燥块莖，另Ij名三 叶半夏，三步跳，麻芋子，地雷公，半夏为多年生草本，块茎圆球形，主要分布于重庆、四川、 湖北、河南和贵州等地。性辛，温，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，临床用于痰多 咳喘、痰饮眩悸、风痰眩晕、呕吐反胃、胸脘痞闷等症，用途广泛。半夏含有多种化学成分，主 要包括有机酸类、生物碱类、半夏蛋白和酚类等。有研宄报道运用小鼠镇咳祛痰药理模型评 价了半夏镇咳祛痰的成分与效应之间的关系，发现有机酸与镇咳祛痰作用具有相关性，对 氨水引咳的小鼠模型皆具有明显的止咳作用，同时还发现半夏有机酸对体外培养的胃癌细 胞有明显的抑制作用，并呈现明显的量效关系。而半夏有机酸类成分中主要包括草酸、甲 酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。目前文献报道对半夏药材及其饮片中有机酸的测定主 要采取电位滴定法，《中国药典》（2010年版）中也采用电位滴定法对半夏中总有机酸含量 进行测定，以琥珀酸含量计算，进行质量控制。
[0003] 电位滴定法测定半夏总有机酸的含量，结果以琥珀酸含量计，该方法只能粗略反 映半夏中有机酸类成分的总量，不能反映半夏中各有机酸成分的具体情况，对含有有机酸 的种类和各自含量高低无法测定出来，显然用该方法来评价半夏质量的真实性、优良性和 稳定性存在缺陷，不够明确和科学。而且电位滴定法测定半夏总有机酸的方法专属性不强， 易受到其他酸性物质以及操作条件的影响。目前还未见采用HPLC法对半夏药材中各种有 机酸进行含量测定的文献研宄。因此，建立一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方 法具有重要意义。本发明对半夏中的草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸进行测定， 作为质量控制的指标更加明确，具体。该方法准确，简便，可以为半夏的质量控制提供参考。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种灵敏度高，专属性强的同时测定半夏提取物中草酸、甲 酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的方法，能够快速、准确的测定它们各自的含量。克服了 现有电位滴定法测定半夏药材中总有机酸方法的缺陷。
[0005] 本发明所述的一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法，按下列步骤进 行：
[0006] (1)样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2. 0g，精密称定，加入40mL水，称定 重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量， 提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置IOOmL容量瓶中，加水定容。精密量取滤液20mL于 小烧杯中，滴加氨水调pH在11. 5-12范围内，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱 水液，再滴加磷酸调pH在2. 0-2. 5范围内，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯， 旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0. 22 μ m滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶 液。
[0007] (2)对照品溶液制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对 照品适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶 液。
[0008] (3)高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行高效液相色谱测定， 色谱柱为 GL InterSustain-C18 (4· 6_ X 250_，5 μ m)，流动相为磷酸调节 pH = 2. 0 的 0.03111〇1.171(順4)4?04缓冲液和甲醇，体积比为97:3，流速为0.81111^1^11- 1，柱温30°〇， 检测波长210nm，对照品溶液和样品溶液各进样20 μ L，采用标准曲线法定量，色谱图记录 与处理由工作站完成，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000。
[0009] 本发明采用HPLC法同时测定半夏中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的 含量，结果这6种有机酸在15分钟内达到基线分离，且分离度均大于1. 5,理论塔板数按草 酸峰计算不低于3000,6种有机酸成分在各自浓度范围内线性良好，相关系数r多0. 9999， 回收率在96. 80% -100. 8%之间。本方法可用于半夏中6种有机酸成分的质量分析，该方 法准确度和灵敏度高，重现性好。
【附图说明】
[0010] 图1混合对照品溶液色谱图（1.草酸，2.甲酸，3.苹果酸，4.乙酸，5.柠檬酸，6.琥 珀酸）
[0011] 图2半夏药材提取物色谱图（1.草酸，2.甲酸，3.苹果酸，4.乙酸，5.柠檬酸，6.琥 珀酸）
【具体实施方式】
[0012] 通过以下实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0013] 实施例1
[0014] 1仪器与试剂：
[0015] 岛津LC-15C型液相色谱仪，LabSolutions LC工作站（日本岛津公司）；AG135型 电子分析天平（瑞士 Mettler toledo公司）；KQ2200B型超声波清洗器（昆山市超声仪有 限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器 股份有限公司）；
[0016] 10个不同产地半夏药材，经重庆太极集团质检部鉴定为天南星科植物半夏 Pinellia ternata(Thunb.)Breit的干燥块莖；草酸对照品（中国食品药品检定研宄院， 批号：100328-201010);甲酸（含量彡98.0%，重庆川东化工有限公司）；乙酸（含量 多99. 5%，重庆川东化工有限公司）；柠檬酸对照品（中国食品药品检定研宄院，批号： 111598-200904);苹果酸对照品（中国食品药品检定研宄院，批号：110736-201129);琥珀 酸对照品（中国食品药品检定研宄院，批号：100525-201102);甲醇为色谱纯（美国天地试 剂公司），实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
[0017] 2方法与结果
[0018] 2. 1 色谱条件：色谱柱为 GL InterSustain-C18 (4. 6_X 250_，5 μ m)，流动相为 磷酸调节pH = 2. O的0. 03mol · T1(NH4)H2PO^缓冲液和甲醇，体积比为97 : 3,流速 0. 8mL · mirT1，柱温30°C，检测波长210nm，进样量20 yL，理论塔板数按草酸峰计算不低于 3000 〇
[0019] 2. 2对照品溶液制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对 照品适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶 液。
[0020] 2. 3样品溶液制备：分别取10个不同产地干燥的半夏药材粉末2. 0g，精密称定，加 入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补 足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置IOOmL容量瓶中，加水定容，精密 量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH为11. 5,用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次， 收集碱水液，再滴加磷酸调PH为2. 5,以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸 发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0. 22 μ m滤膜滤过，取续滤液，即为10个不同产地 的半夏样品溶液。
[0021] 2. 4线性关系考察：取对混合照品溶液，逐级稀释得系列混合对照品溶液，按2. 1 项下色谱条件进样20 μ L测定，以峰面积为纵坐标，分别以6种有机酸对照品溶液的浓度 (μ g mr1)为横坐标，绘制标准曲线，6种有机酸的线性回归方程，相关系数，浓度线性范围 见表1。
[0022] 表1 6种有机酸的线性回归方程、相关系数及线性范围
[0023]
【主权项】
1. 一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法，其特征在于包括下列步骤： (1) 样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2.Og，精密称定，加入40mL水，称定重量， 超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液 用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容，精密量取滤液20mL于小烧杯 中，滴加氨水调pH在11. 5-12范围内，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液， 再滴加磷酸调pH在2. 0-2. 5范围内，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸 发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0. 22 y m滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液； (2) 对照品溶液制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对照品 适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶液； (3) 高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行高效液相色谱测定，色谱柱为 GLInterSustain_C18，流动相是磷酸调节pH = 2. 0的0? 03mol ? I71 (順4)]^04缓冲液和甲 醇，体积比为97 : 3,流速0. 8mL ? mirT1，柱温30°C，检测波长210nm，对照品溶液和样品溶 液各进样20 yL，采用标准曲线法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按草 酸峰计算不低于3000。
【专利摘要】本发明涉及一种同时测定半夏中6种有机酸含量的方法，该方法包括以下步骤：(1)样品溶液制备(2)对照品溶液制备(3)高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定分析，色谱柱为GL InterSustain-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为磷酸调节pH＝2.0的0.03mol·L-1(NH4)H2PO4缓冲液和甲醇，体积比为97∶3，流速为0.8mL·min-1，柱温30℃，检测波长为210nm。在该方法条件下，半夏中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸同时得到了有效分离，且方法学结果均符合分析测定要求。该方法相比以前电位滴定法测定总有机酸的含量更为明确和客观，能有效、快速的测定半夏中6种有机酸的含量，可更全面、更准确的用于半夏药材的质量控制。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104597160
【申请号】CN201510044750
【发明人】何丹, 张景勍, 孙全, 杨林
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月27日