缓冲液，按照常规方法配制)过柱，并使用0.01% NaN3-PBS保存，即制成3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱。
[0022](6)柱子再生:先用0.1M醋酸-醋酸钠(pH 4.0，内含0.5M NaCl)缓冲液洗涤，接着再用0.1M Tris-HCl (pH8.0，内含0.5M NaCl)缓冲液进行洗涤，洗涤至少3个循环。
[0023]上述缓冲液都是本领域常用的缓冲液或购自商业公司或参照相关的教科书或已经公开的文献，例如华中农业大学授权专利，专利号ZL201110036167X “一种甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用”，或者参考华中农业大学授权专利，专利号ZL2013102142017 “抗伏马菌素BI的单克隆重组抗体H7”报道的方法方法。
[0024]实施例2:免疫亲和柱和高效液相色谱法测定3-甲基喹噁啉-2羧酸
[0025](I)样品的提取和净化
[0026]分别取猪肌肉和猪肝组织样品匀浆物，猪肉和猪肝中分别添加3-甲基喹噁啉-2羧酸。样品采用1.5mol/L HCl和乙酸乙酯超声(按照常规方法)提取，氮气吹干后，用PBS缓冲液溶解残渣。将此溶解液过亲和柱，用PBS缓冲液淋洗亲和柱。用甲醇溶液洗脱，收集甲醇溶液(亲和柱要立即再生)，将甲醇溶液用氮气吹干，再用0.1%甲酸和乙腈溶液(20/80，V/V)溶解，待进行液相色谱测定。
[0027](2)样本测定(技术条件)
[0028]色谱柱:ZorbaxEclipse XDB C18柱(250X4.6mm, 5 μm)；
[0029]流动相:0.1%甲酸和乙腈；
[0030]流速:1.0mT ,/mi η ；
[0031]紫外检测器测定波长:320nm。
[0032](3)检测结果
[0033]在猪肌肉中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸浓度为4 μ g/kg?16 μ g/kg时，回收率为78.2%?90.6%，批间变异系数为6.8%?7.7%。在猪肝中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸浓度为10 μ g/kg?100 μ g/kg时，回收率为82.2%?93.1%，批间变异系数为6.1%?8.5%。本方法在猪肌肉和猪肝中定量限分别为4 μ g/kg和10 μ g/kg。
[0034]从以上数据可以看出，采用本发明制备的3-甲基喹噁啉-2羧酸浓度免疫亲和柱，用于猪肌肉和猪肝样品中3-甲基喹噁啉-2羧酸的检测，添加回收率和变异系数能满足该药物残留检测要求。这表明本发明制备的免疫亲和柱性能稳定、结果可靠，完全，可以满足
3-甲基喹噁啉-2羧酸的检测需要。
[0035]主要参考文献
[0036]1.章谷生等.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版社，1987年版.
[0037]2.华中农业大学授权专利，金梅林等，专利号201110036167X “一种甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用”，2011年.
[0038]3.华中农业大学授权专利，廖玉才等，专利号2013102142017 “抗伏马菌素BI的单克隆重组抗体H7”，2013年。
【主权项】
1.一种分泌3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:C201147。
2.—种检测3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱，其特征在于，由空柱管和琼脂糖凝胶组成，所述的琼脂糖凝胶上偶联了保藏号为CCTCC NO:C201147的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体。
3.一种检测3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱的制备方法，其特征在于下列步骤: (1)基质制备:用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sephar0Se4B用ImM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用I mM HCl洗涤； (2)偶联:预先将纯化好的由保藏号为CCTCCNO:C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体置于0.1M NaHCO3PH 8.3的偶联缓冲液中透析，使用0.1M NaHCO3PH 8.3的偶联缓冲液洗涤溶涨后经CNBr活化的S印harose 4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的S印harose 4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h ;用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物； (3)封闭活性基团:将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1M Tris-HCl缓冲液中，4°C静止 16h ； (4)洗涤:将步骤(3)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液中各淋洗一次，重复此洗涤过程三次； (5)装柱:采用湿法装柱，将步骤(4)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入固相萃取空柱管中，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01 % NaN3-PBS过柱，并使用0.01 % NaN3-PBS保存，即制成3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱； (6)柱子再生:先用内含0.5M NaCl的pH为4.0的0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤，接着再用PH为8.0，内含0.5M NaCl 0.1M Tris-HCl缓冲液进行洗涤，洗涤至少3个循环。
4.权利要求1所述的一种分泌3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10在制备3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱中的应用。
【专利摘要】本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱及其制备方法。该免疫亲和柱由空柱管和琼脂糖凝胶组成，在所述的琼脂糖凝胶上偶联了保藏号为CCTCC NO：C201147的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体。本发明的免疫亲和柱能与3-甲基喹噁啉-2羧酸特异性结合，最大结合容量为240ngDMT。该免疫亲和柱主要用于动物性产品中的3-甲基喹噁啉-2羧酸的纯化，以便后期对样本中3-甲基喹噁啉-2羧酸含量进行高效液相色谱检测。CCTCC NO：C2011472011.06.29
【IPC分类】G01N30-60
【公开号】CN104597178
【申请号】CN201510018577
【发明人】袁宗辉, 陈冬梅, 张西亚, 彭大鹏, 潘源虎, 陶燕飞, 谢书宇, 黄玲利, 王玉莲, 刘振利
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月14日