基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光学成像技术、生物医学领域，特别是一种基于双通道的多光谱荧光 成像显微系统和方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生物医学研宄的进展，利用荧光寿命显微成像的方法获取生物光子 学信息的手段逐渐被采用。结合荧光强度成像，荧光寿命成像方法可用于细胞微环境检测， 光谱重叠的荧光团成像，具体可以完成荧光共振能力转移、细胞内物理化学环境例如氧离 子浓度、钙离子、PH值的定量监测等。
[0003] 目前，可对荧光寿命进行探测的荧光显微成像系统主要包括：单光子荧光计数荧 光显微系统，门控荧光显微成像系统，频域荧光显微成像系统；以上几种荧光显微系统都可 以同时获取荧光强度成像和荧光寿命成像。
[0004] 现有的技术中，荧光显微系统多是针对单一波长的荧光团进行监测，或者是利用 光谱仪结合探测器对兴趣波长进行成像融合；以上设备利用的方法在光学信息获取是针对 动态过程的单一波段，或者针对兴趣波段逐一探测，例如活体细胞的动态监测、FRET过程 等，现有系统无法针对整个监测过程的多个兴趣波段进行同时获取并对图像信息进行融合 处理。从而，利用双通道的探测器对多波长的相同目标活动的检测可以满足动态过程中的 荧光光谱信息，荧光强度信息，荧光寿命信息同时获取的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种基于双通道的多光谱荧光成像显微系统和方法。本发明 实施例的基本思路是将利用分光镜的分束的双通道探测方法和门控荧光寿命成像显微方 法结合，实现基于双通道的多光谱荧光成像显微系统。
[0006] 该基于双通道的多光谱焚光成像显微系统，包括：光源模块，光斑整形光路，焚光 激发收集光路，双通道光路，双ICCD、时序信号产生器和PC机，其特征在于：所述光源模块， 用于激发荧光样品，使样品表面产生光致荧光信号；
[0007] 所述光斑整形光路包括光纤耦合输出装置、扩束镜，用于将自由空间输出的激发 光经光纤耦合输出后，采用扩束镜进行光斑扩束，用于适应激发样品大小，实现宽场激发；
[0008] 所述荧光激发收集光路包括双色镜、反射镜、物镜，激发光经由右侧双色镜反射至 反射镜表面，反射镜位于双色镜左侧，激发光反射至反射镜上方的物镜内；物镜将激发光会 聚到样品表面完成荧光样品激发，并收集样品表面出射的荧光信号，双色镜用于分离激发 光束和荧光信号，实现荧光样品的激发和收集，对于激光全部反射，荧光信号全部透射；所 述反射镜用于光路中激发光和荧光的光路角度调整，方向调整90度；
[0009] 所述双通道光路，包括：分光棱镜、透镜L3、透镜L4、滤光片F1、滤光片F2,其中所 述分光棱镜，用于将焚光信号分成50 : 50的焚光强度信号，50%透射、50%反射实现双通 道探测；所述透镜L3、L4,用于调整荧光在探测器上成像的清晰度和大小；所述滤光片F1、 F2,用于选择荧光信号中的兴趣波段，实现兴趣光谱成像；
[0010] 所述双ICCD(增强型电荷耦合器件探测器）探测两路兴趣波段的时间分辨荧光强 度图像；
[0011] 所述时序信号产生器输出三路电学触发信号，用于触发短脉冲激光器、第一ICXD、 第二ICCD，完成时序电路控制；
[0012] 所述PC机同时连接时序信号产生器、双1C⑶的图像输出端口，用于系统探测参数 的输入、成像系统的控制以及荧光寿命图像计算和融合处理。
[0013] 按照本发明的一方面，一种利用双相机的多光谱荧光成像显微系统，包括：
[0014] 光源模块，紫光372nm、绿光440nm或者根据实际荧光样品选定近紫外至可见光波 段皮秒半导体脉冲激光头可选的）皮秒脉冲激光器，用于观察样品中荧光激发；
[0015] 激光器光斑整形光路，包括光纤親合输出装置，扩束镜。用于将自由空间输出光光 纤耦合输出后，利用扩束镜进行光斑扩束；
[0016] 双色镜，反射镜，物镜，激发光经由右侧双色镜反射至反射镜表面，反射镜位于双 色镜左侧，激发光反射至反射镜上方的物镜内，三者共同位于荧光激发收集光路上。脉冲激 光经双色镜发射并经过物镜入射到观测样品表面，样品受激发的荧光经反射镜并透过双色 镜至荧光探测光路。
[0017] 分束镜，用于将样品焚光分束成强度50/50的两路信号；
[0018] 透镜L3,透镜L4,滤光片F1，滤光片F2,经由分束镜的焚光信号经由親合透镜，兴 趣波段的滤光片滤除后耦合到ICCD探测器；
[0019] 双ICCD(增强型电荷耦合器件探测器），用于探测两路兴趣波段的时间分辨荧光 强度图像；
[0020] 时序信号产生器，用于输出三路电学触发信号，同步脉冲激光器、第一ICXD、第二 ICCD，完成时序电路控制；
[0021] PC机，同时连接时序信号产生器，两路1C⑶的图像输出端口。用于输入控制信号 产生器的参数和输出控制参数，并通过相机图像控制软件实时显示并存储样品荧光强度图 像，在获取全部时序控制参数和时间分辨荧光强度图像后，利用荧光寿命算法处理并显示 多种荧光图像信息。
[0022] 系统中光学部件位置如系统光路图图2中所示，双色镜进行不同波长的激发光和 荧光信号的分离，分束镜实现荧光信号分束后的双通道探测。PC机通过以太网控制时序信 号输入，时序产生器利用三路TTL信号（数字逻辑信号）触发半导体激光器和ICCD探测器， 获取图像通过以太网线传入PC机设备。
[0023] 系统中通过控制时序产生器的TTL信号的位置，调整激发光脉冲同探测门的位 置，实现时间分辨荧光强度信号的探测，延迟精度<l〇ps。
[0024] 按照本发明的另一方面，一种利用上述的基于双通道的多光谱荧光成像显微系统 成像的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
[0025] 步骤1，PC机输入成像系统控制参数，实现系统探测参数初始化；
[0026] 步骤2,时序产生器接受到PC机设定TTL参数，驱动激光器和ICXD探测器开启，激 发光传播到样品表面完成荧光激发，双ICCD(增强型电荷耦合器件）探测器在延迟信号驱 动下分别获取多波长荧光信号，完成光学信号探测过程；
[0027] 步骤3,PC机读取多组延迟信息，时间分辨荧光强度图像，获取全部待处理的时间 和图像彳目息；
[0028] 步骤4,荧光寿命处理软件计算寿命图像并进行融合等操作，完成多光谱荧光信号 探测。
[0029] 本发明基于双通道的多光谱荧光成像显微系统，针对性获取兴趣波段的荧光强度 图像和荧光寿命图像，实现了多光谱的荧光显微成像，突破了原有单一波段和重复获取多 波长的探测限制，极具科学意义和应用价值。
【附图说明】
[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以及结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明，其中：
[0031] 图1是本发明实施例提供的双通道多光谱荧光成像显微系统的处理流程图；
[0032] 图2是本发明实施例提供的双通道多光谱荧光成像显微系统的系统光路图。
【具体实施方式】
[0033] 应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034] 图1表示了本发明实施例提供的基于双通道的多光谱荧光成像显微方法的具体 实现流程，详述如下：
[0035] 在步骤1中，选定观察目标为活体仓鼠的口腔癌细胞，两路的兴趣荧光波段分别 为450nm、550nm，主要针对的两种生物自体荧光团为NADH(还原型烟酰