食品中致病菌检测的巨磁阻抗效应生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种食品中致病菌检测的巨磁阻抗效应生物传感器，属于食品中致病 菌的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 微生物的快速检测对临床检验、食品安全以及环境监测都是至关重要的。据WHO 估计，全世界每年发生食源性疾病数十亿人，每年约有二百万儿童死于腹泻.其中66%以 上是由致病菌所致。食品中致病菌一般包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结 肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌〇157:H7、副溶 血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等，其中以沙门氏菌、大肠杆菌0157 :H7、李斯特 氏菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病尤为突出。因此，建立对食品中不同致病菌的快速、 准确、特异性强、简便的检测方法，对保障食品安全十分必要。
[0003] 目前食品卫生中常规的微生物检测方法是增菌培养、平板计数法，由于其检测周 期长、工作量大、容易造成误差、漏检率高、程序复杂等缺点已远远不能满足现代检测要求。 随着现代科学技术的不断发展和分子细菌学研宄的开展，特别是免疫学、生物化学、分子生 物学的不断发展，出现了一些较为先进的、快速的检测方法，如聚合酶链反应（PCR)、多重 PCR、荧光PCR、免疫学检测、质谱测定、DNA探针法等检测方法，但是大都普遍存在仪器成本 昂贵、操作复杂等缺点，不易在实际应用中普及和现场快速检测和诊断。
[0004] 生物传感器是近几十年来发展起来的一种新的传感器技术，它是利用生物活性材 料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等）与物理化学换能器（电化学、光学、机械、热、 电、磁等）有机结合构成的一种生物信息检测分析工具。生物传感器由于其独特的优势， 如能在浑浊溶液中操作、选择性好、灵敏度高等，其所测的信号通常是电信号的变化，可以 直接测量，便于仪器自动化、小型化和智能化。然而传统的生物传感器的分析操作步骤太 多、分析周期长、价格昂贵、体积大、昂贵的光学检测设备及需要训练有素的专业人员才能 完成等。近年来，由于免疫磁珠技术的不断进展和微传感器技术的发展，科学家们提出了 将微纳磁传感器并结合磁性标签研制用于生物学、医学、遗传学、毒物学等生物信息探测 的新型生物传感器。利用磁传感器并结合磁性标签用于探测生物分子的理念最早是由美 国海军实验室的Baselt等[BaseltD.R.,LeeG.U.，NatesanM.，MetzgerS.W.,Sheehan P.E.,ColtonR. ,Abiosensorbasedonmagnetoresistancetechnology,Biosens. Bioelectr. 17(1998)731.]于1998年提出的，由此开启了磁生物传感器研宄的热潮。
[0005]经对现有技术的文献检索发现，Kurlyandskaya等（Kurlyandskaya G. V.，Sanchez M.L.，Hernando B.)在《Appl.Phys.Lett.》（美国应用物理快报）《Vol.82，pp.3〇53,2〇〇3》 首次提出使用巨磁阻抗效应传感器来探测磁性纳米粒子，并利用CoFeMoSiB非晶带材制 备了探测装置，成功实现了对商业FerroHuicf液体中磁性纳米粒子以及Dynabeads1 M-450磁珠的探测。2007年，Kurlyandskaya等（A. Kumar, S. Mohapatra, V. F. Miyar, A. Cerdeira,J.A. Garcia, H. Srikanth,J.Gass and G. V. Kurlyandskaya)在〈〈Appl. Phys. Lett.》（美国应用物理快报）《Vol. 91，pp. 143902, 2007》报道了利用巨磁阻抗效应传感器 对吞噬Fe304纳米粒子的人体胚肾细胞（HEK293)进行检测，证明了巨磁阻抗效应在生物医 学检测领域的可行性，但该研宄工作只是得到了巨磁阻抗效应传感器对Fe304磁性纳米粒 子的响应，没有实现对细胞样品的标记和分型检测。
[0006] 随着微机电系统（MEMS)技术的发展，利用MEMS技术制备的微流控芯片已应用于 生物与医学检测领域，而MEMS技术同样可用来制造小型化、集成化的巨磁阻抗效应传感 器。将生物信息的固定与小型化巨磁阻抗效应传感器相结合构建新型致病菌检测系统，利 用磁性标签对致病菌进行检测，具有重要的研宄意义和临床价值。通过文献和专利检索，没 有发现关于将巨磁阻抗效应传感器用于致病菌检测的相关研宄成果。
[0007] 中国专利申请号为201210397978. 7,公开号102937649A，该专利公开了一种血清 肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器，包括微型化磁通门传感器、生物芯片、施加轴 向磁场的螺线管线圈、以及与微型化磁通门传感器连接的信号采集系统，其中：所述生物芯 片位于微型化磁通门传感器的敏感轴上，所述生物芯片由位于玻璃基片上的Au膜、位于Au 膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性标签组成。但是该发明专利只是针对血清肿 瘤标志物进行检测，无法实现对致病菌的检测。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种食品中致病菌检测的巨磁阻抗 效应生物传感器。该巨磁阻抗效应传感器芯片采用MEMS加工工艺制作，与致病菌捕获芯片 配套使用，与配套的检测电路一起可实现整个系统的小型化，对致病菌的检测，具有检测芯 片面积大，检测灵敏度高，不需要对生物样本进行增菌培养和PCR扩增，可以直接检测液体 食品中的致病菌，其检测灵敏度为l〇-l〇〇CFU/ml。
[0009] 为了实现上述目的，本发明所述食品中致病菌检测的巨磁阻抗效应生物传感器包 括巨磁阻抗效应传感器芯片、致病菌捕获芯片、施加轴向磁场的磁芯螺线管线圈、以及与 巨磁阻抗效应传感器连接的信号采集系统，其中：所述致病菌捕获芯片由玻璃基片上的Au 膜、Au膜上修饰了一层生物敏感膜、生物敏感膜固定了致病菌单克隆抗体，致病菌单克隆抗 体捕获带有磁性标签的致病菌，致病菌与生物素修饰的致病菌单克隆抗体结合，致病菌通 过生物素与亲和素作用与磁性标签相连，磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由 其构成的磁珠，采用磁分离技术对带有磁性标签的致病菌进行富集和分离。
[0010] 优选地，上述的巨磁阻抗效应传感器芯片由位于玻璃基片上的F/Cu/F(F=软磁 薄膜）多层膜构成，Cu膜宽度小于软磁薄膜F的宽度，传感器外形呈曲折形结构，并采用 MEMS工艺制作，其中软磁薄膜F为NiFe薄膜或CoZrNb薄膜或CoFeSiB薄膜等。
[0011] 优选地，所述的致病菌捕获芯片上的Au膜为溅射的Cr/Au薄膜，用于修饰生物敏 感膜；所述的生物敏感膜可以连接各种致病菌单克隆抗体，致病菌单克隆抗体可以和被检 测的致病菌结合。致病菌与生物素修饰的致病菌单克隆抗体结合，致病菌通过生物素与亲 和素作用与磁性标签相连，磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由其构成的磁 珠，采用磁分离技术对致病菌进行富集和分离。
[0012] 优选地，所述施加轴向磁场的磁芯螺线管线圈为一绕制在PVC上的小型化磁芯螺 线管线圈，通过外接的直流电源产生轴向均匀磁场，磁场高达l〇〇〇e，而空心的螺线管是无 法达到的；巨磁阻抗效应传感器的敏感轴放置在磁芯螺线管线圈的轴向位置上，致病菌捕 获芯片位于巨磁阻抗效应传感器芯片的上方，间距不超过100ym。
[0013] 优选地，所述生物敏感膜连接各种致病菌单克隆抗体，致病菌单克隆抗体捕获被 检测的带有磁性标签的致病菌。
[0014] 优选地，所述的信号采集系统为HP4294A或E4991A阻抗分析仪或采用信号发生 器、交流恒流源、锁相放大原理等构成的信号采集系统，可测量磁性标签引起的阻抗大小 或电压信号与检测致病菌之间的关系。
[0015] 磁分离技术是以纳米或微粒级的磁性颗粒为载体，利用结合于磁性颗粒表面修 饰的蛋白质所提供的蛋白-蛋白之间的特异亲和特性，在施加磁场的装置控制下，通过免 疫亲和吸附、清洗、解吸操作，从复杂的生物样本中分离得到目标生物分子，具有磁性分离 简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。本发明采用磁分离技术利用磁性标 签对致病菌进行富集和分离，其具体操作过程残见实施例。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0017] (1)本发明采用巨磁阻抗效应传感器检测致病菌，芯片采用MEMS技术制作，具有 较大的传感器芯片面积，传感器具有高的磁场检测灵敏度；
[0018] (2)致病菌捕获芯片采用MEMS技术设计制作，致病菌捕获芯片表面上的Au膜修饰 了生物敏感膜，生物敏感膜固定了致病菌单克隆抗体，致病菌单克隆抗体可以捕获致病菌； 采用磁分离技术对致病菌进行富集和分离，不需要对生物样品进行增菌培养和PCR扩增， 致病菌与生物素修饰的致病菌单克隆抗体结合，致病菌通过生物素与亲和素作用与磁性标 签相连，磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由其构成的磁珠。采用磁分离技术 将带有磁性标签的致病菌从生物样本中分离出来，大大缩短了检测时间；
[0019] (3)生物样品本身不带磁性，能提供一个很低噪声的磁测量环境，相对于荧光分 子、放射性同位元素、酶等标签，磁性标签非常稳定；
[0020] (4)本发明中的食品中致病菌检测系统具有检测速度快、可重复使用、无特殊环境 和存放要求、体积小、灵敏度高等优点，缺点是不能对固体样品中的致病菌直接进行检测； 本发明的巨磁阻抗效应传感器不需要依赖于操作人员的生物学医学经验以及庞杂、昂贵的 荧光检测设备，就可实现特定的生化分析或致病菌检测，这将有利于实现便携式、成本低 廉、快速诊