用于测量被分析物跨屏障转运的方法和装置的制造方法
【专利说明】用于测量被分析物跨屏障转运的方法和装置
[0001]本申请为国际申请日2009年7月I日、国际申请号PCT/US2009/049444于2011年I月4日进入中国国家阶段、申请号200980125952.3、发明名称“用于测量被分析物跨屏障转运的方法和装置”的分案申请。
[0002]相关申请/要求优先权
[0003]本申请涉及并要求2008年7月I日提交的名称为用于测量化学物质跨细胞膜转运的免标记测定法的临时申请N0.US61/133, 697 ;以及2009年2月20日提交的名称为用于测量跨膜转运的方法和装置的临时申请N0.US61/208, 115的优先权；并且这些临时申请并入本文作为参考。
[0004]政府的权利
[0005]本发明根据美国国立卫生研宄院授予的合同号1R43GM080781-01在美国政府的支持下进行。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
[0006]本发明涉及用于测量跨膜转运率的方法和装置。
【背景技术】
[0007]对潜在重要药物的鉴定常常需要测量这些药物对离子跨膜转运的影响。例如，一些药物所产生的危及生命的毒性与心脏复极化延迟或与离子的迀移有关的QT间期延长有关。例如，近来有数种药物退市的原因就是其对细胞膜转运系统有影响。
[0008]离子通道是无所不在的允许离子跨细胞膜转运的成孔蛋白。离子通道促进特定离子种类(例如，Na+，K+，Ca2+，CF)在细胞小室之间和/或跨过具有不同离子选择性的外部细胞膜的迀移。离子通道为动态结构，其对外界因素，如电压梯度，配体和机械力产生应答。制药工业开发出了改变离子通道功能的治疗法。例子包括抗癫痫剂，如钠离子通道阻滞剂卡马西平，抗高血压剂二氢吡啶类钙通道阻滞剂(络活喜)和用于糖尿病的磺脲类钾通道开放剂(亚莫利)。近来，离子通道靶向药物的总年销售额为200亿美元。
[0009]对于药物开发，离子通道是较难的分子靶点。困难缘于适宜高通量筛选分析形式的缺乏，离子通道生物物理学的复杂性，以及药物的潜在结合位点和结合模式的范围。
[0010]对用于测量离子的跨膜转运率的更简单方法的需求仍然存在。
[0011]因此，本发明的目的在于提供用于测量离子的跨膜转运率的方法和装置。
[0012]本发明的其它目的，优点和新特征一部分将在下面的描述中提及，一部分对本领域技术人员而言可以通过研宄下文而变得显而易见，或者通过本发明的实施来获悉。本发明的目的和优点可以通过权利要求书中特别指出的仪器和组合物来了解和获得。
[0013]附图简述
[0014]合并入并形成说明书的一部分的【附图说明】了本发明的实施方案，并与描述一起起到解释本发明的原则的作用。在图中:
[0015]图1显示了本发明的方法的流程图；
[0016]图2显示了本发明的方法的另一流程图；
[0017]图3显不了本发明的装置的不意图；
[0018]图4显不了本发明的装置的另一不意图；
[0019]图5显示了水中X射线的Ι/e衰减深度计算值的曲线
[0020]图6显示了一组铷流出率数据。
[0021]图7显示了铷流出率对抑制剂浓度的曲线。
[0022]图8显示了本发明的装置的示意图。
[0023]图9显示了本发明的装置的示意图。
[0024]图10显示了本发明的装置的示意图。
【发明内容】
[0025]简而言之，本发明包括用于测量从细胞转运被分析物的方法。该方法包括提供一种或多种载有被分析物的细胞的步骤。然后从细胞上卸载至少部分被分析物。随后用X射线荧光测量被分析物。
[0026]本发明还包括用于测量向细胞内转运被分析物的方法。该方法包括提供一种或多种细胞；增加细胞内被分析物的量；以及用X射线荧光测量被分析物的步骤。
[0027]本发明还包括用于测量化学物质跨细胞屏障转运的装置。该装置包括有入口，出口和用于在交换腔室中的溶液期间保留细胞的机构的腔室。该腔室还有至少一个半透过X-射线的位置。该装置还包括定向至通过腔室中的半透过X-射线位置对细胞进行分析的X-射线荧光分光仪。
【具体实施方式】
[0028]简而言之，本发明涉及用X射线荧光(XRF)测量化学物质跨膜转运的有效率。
[0029]本发明的方法的实施方案显示在图1中。该实施方案包括提供载有被分析物的细胞的步骤。然后将细胞暴露于导致其卸载被分析物的条件下。用X射线荧光测量被分析物。优选地，被卸载的被分析物从一个体积中基本上去除，所述体积由入射到细胞上的X射线荧光激发光束的面积，以及被分析物在水中的至少一种特征性信号的Ι/e深度的5倍的深度来确定。
[0030]本发明的方法的另一实施方案显示在图2中。该实施方案包括提供细胞，然后装载被分析物，以及用X射线荧光测量被分析物的步骤。优选地，在细胞负载之前，在一个体积中，被分析物基本上被耗尽，所述体积由入射到细胞上的X射线荧光激发光束的面积，以及被分析物在水中的至少一种特征性信号的Ι/e深度的5倍的深度来确定。
[0031 ] 在本发明的方法的两种实施方案中，相似组分和步骤的特性是相同的。
[0032]细胞优选为活的优选表达离子通道的生物细胞。应该理解的是，细胞可以是组织的一部分；或者，术语细胞可以指有膜的亚细胞组分，如线粒体；或其它提供有限的被分析物转运的亚细胞组分，如内质网，或微胞(micelle)等。更优选的是，细胞过量表达离子通道。通常，细胞应基本上被物理屏障，如膜或壁限定，所述物理屏障封闭了大量物质，如被分析物，水，蛋白质，DNA和其它生物化学物质。物理屏障具有的特性为暴露于不同刺激物时，其可以使被分析物以不同速率通过。例如，物理屏障可以是包括离子通道或其它膜蛋白的细胞膜，其中离子通道在抑制剂或激活剂存在下使离子以不同速率通过。优选细胞是粘附性的。与本发明相容的细胞系的例子有可获自法国CreaCell, B1polis, 5，avenue duGrand Sablon, 38700 La Tranche 的 hERG CHO-Kl 细胞系。
[0033]被分析物优选包括原子序数大于10的化学元素，更优选选自锌，镉，铊，钠，钾，铷，铯，镁，钙，钡，锶，氯，溴和碘的化学元素。更优选的是，被分析物包括具有至少一种能量为2.5KeV或2.5KeV以上的特征性x射线荧光发射信号的化学元素。细胞优选掺入一定量的被分析物，以使一定体积内的细胞群含有至少1pg被分析物，所述体积由入射到样品上的来自X射线荧光仪器的X射线激发光束的面积，以及水衰减时被分析物的至少一种特征性X射线信号的Ι/e衰减深度的5倍的深度来确定；lKeV至20KeV间的x射线能量的1/e深度见图5。更优选细胞包括，掺入或内化一定量的被分析物，以使一定体积内的细胞群含有1nmol至5mol浓度的被分析物，所述体积由入射到样品上的来自x射线焚光仪器的x射线激发光束的面积，以及Ι/e衰减深度的5倍的深度来确定。
[0034]细胞优选为固定化的；本文中的固定化的含义是，数量等于X射线荧光测量开始时位于X射线荧光激发光束的光路中的细胞的至少I %的细胞在X射线荧光激发光束的光路中保留的时间大于X射线荧光测量的测量时间。更优选的是，本文中的固定化的含义是，数量等于X射线荧光测量开始时位于X射线荧光激发光束的光路中的细胞的至少1%的细胞在X射线荧光激发光束的光路中保留至少10s。
[0035]将细胞固定化的方法的例子包括以下方法:细胞可以通过保留细胞并允许第一溶液和第二溶液通过的滤器来固定。优选细胞通过附着于固体支持物来固定，所述固体支持物如泡沫，片材，薄膜，膜，支架，凝胶，粘附因子，粘附细胞系，组织，差异扩散速率(differential diffus1n rates)，流体力(f luidic forces)，或分化细胞或其它细胞可以附着的表面。细胞可以是粘附性的，或者是组织或其它分化细胞团的一部分。如果使用泡沫，优选开孔泡沫，最优选部分网状开孔泡沫。
[0036]被分析物可以方便地通过除去支持细胞的任何溶液，并加入第二溶液来卸载。第二溶液可以在除去第一溶液后加入，例如，倒出第一溶液或从第一溶液中滤出细胞，然后加入第二溶液。或者可以将第二溶液加入到第一溶液中，以使第二溶液替换第一溶液。第二溶液是方便添加一种或多种刺激物以释放被分析物的方法。刺激物优选包括至少一种选自以下目录的物质:诱导被分析物穿过物理屏障的化学物质，抑制被分析物穿过物理屏障的化学物质，其中被分析物基本上被耗尽的溶剂，诱导离子通道活性的化学物质，以及抑制离子通道活性的化学物质；这种离子通道活性的抑制可以是直接的，例如，抑制剂与离子通道结合；或者是间接的，例如，化学物质通过与辅助蛋白或辅因子等结合来抑制离子通道活性；抑制的机制对本发明实现功能而言并不重要。第一溶液可以方便地通过用第二溶液替换或