一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药领域，具体涉及一种快速分析鉴定裸花紫珠中各种黄酮类成分的 方法，为裸花紫珠制剂的质量控制提供可行依据。
【背景技术】
[0002] 裸花紫珠 （Callicarpa nudifIora Hook, et Arn.)为马鞭草科（Verbenaceae) 紫珠属植物，主要产于广东、海南、广西等地。具有止血、祛瘀、止痛之功效，主要用于肺咯 血、胃肠出血、鼻衄、牙龈出血、外伤出血、跌打损伤、风湿肿痛等。裸花紫珠的主要成分为 黄酮、鞣质类。目前主要通过紫外分光光度法测定总黄酮的含量，但该方法非常有限，不够 全面；现有的对裸花紫珠化学成分研究中，也没有单独对黄酮类成分的分析鉴定研究。液 质联用技术（HPLC-MS)是目前广泛应用的分析方法之一，它利用液相色谱的高效分离能力 对被分析样品进行分离。再以质谱为检测器在线提供化合物的分子量信息，特别是电喷雾 (ESI)软电离质谱技术的出现，为研究热不稳定和极性较大的化合物提供了简捷快速的分 析方法，而多级串联质谱技术还可以提供被分析成分的结构信息。本发明利用液质联用技 术（HPLC-ESI-MS)对裸花紫珠药材中的黄酮类成分进行分离及结构鉴定，有利于进一步提 高裸花紫珠药材以及裸花紫珠制剂的质量控制标准。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是建立一种有效的裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法。
[0004] 本发明所述的裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法包括下列步骤：
[0005] (-）样品制备
[0006] 取裸花紫珠药材，加水浸泡0. 5~2h，煮提1~2h，过滤，药渣再加水煮提1~2h， 合并两次滤液，减压浓缩至相对密度I. 1~I. 3 (60°C);准确称取2~2. 5g于离心管中， 加入甲醇5~10ml，混匀，超声提取0. 5~2h后离心，转速为8000~10000rad/min，取上 清液加入2~2. 5g聚酰胺粉，水浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于砂芯漏斗，纯水洗涤2~4 次，每次5~20ml，再用20~30%%甲醇洗涤2~3次，每次5~20ml，弃去洗涤液，用70~ 80%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇8~10ml，第三次加入甲醇3~5ml，洗脱液加入70% 甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析；
[0007] (二）仪器条件
[0008] (1)液相色谱条件
[0009] ThermoFisher Hypersil Gold C18 色谱柱（3 μ m，2. 1x150mm);流动相为甲醇和 〇· 1%的甲酸水溶液，梯度洗脱（0~2min，甲醇75% ;2~47min，甲醇75%- 45% ;47~ 52min，甲醇 45 % - 10 % ;52 ~57min，甲醇 10 % ;57 ~58min，甲醇 10 % - 75 % ;58 ~ 70min，甲醇 75%);流速：0· 2ml/min ;柱温：30° C ;进样体积：5μ 1。
[0010] (2)质谱条件
[0011] (I)全扫描电喷雾电离（ESI)，正/负离子方式，扫描范围200 - 1500Μ，扫描时间 ls，分辨率Q1=0.7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C， 辅助气（N2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力0u，源内CID电压0V。
[0012] (II)二级质谱扫描电喷雾电离（ESI)，正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Ql=O. 7FWHM，Q3=0. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C， 辅助气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力0u，源内CID电压0V，碰撞气（Ar)压力I. 5mTorr， 碰撞能量15/30eV。
[0013] (III)三级质谱扫描电喷雾电离（ESI)，正/负离子方式，扫描时间0. 5s，分辨率 Ql=O. 7FWHM，Q3=0. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C， 辅助气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力0u，源内CID电压30V，碰撞气（Ar)压力I. 5mTorr， 碰撞能量15/30eV。
[0014] (IV)中性丢失扫描电喷雾电离（ESI)，负离子方式，扫描范围350 - 1500M，扫描 时间0· 6s，分辨率Ql=O. 7FWHM, Q3=0. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细 管加热温度350°C，辅助气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力Ou，源内CID电压0V，碰撞气 (Ar)压力I. 5mTorr，碰撞能量15/30eV，中性丢失基团分子量132、146、162、176、308。
[0015] 步骤(一）样品制备可优选为：
[0016] 取裸花紫珠药材，加15倍量水浸泡30min，煮提2h，过滤，药渣再加15倍量水煮 提2h，合并两次滤液，减压浓缩至相对密度I. 2 (60°C);准确称取2g于离心管中，加入甲醇 7ml，混匀2min，超声提取30min后离心5min，转速10000rad/min，取上清液加入2g聚酰胺 粉，水浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于G3砂芯漏斗，纯水洗涤4次，每次10ml，再用20%甲 醇洗涤2次，每次10ml，弃去洗涤液，用70%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇10ml，第三次 加入甲醇5ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析。
[0017] 按实施例1所得制备液按实施例1的液相色谱条件和质谱条件进行全扫描分析得 到其总离子流图（见附图1)，参照NCBI和文献报道黄酮类化合物的分子量，确定其分子离 子，然后从总离子流图中提取该化合物的分子离子，若存在，并对其进行二级、三级和中性 丢失分析，确认其结构。通过化合物的一级质谱、二级质谱、三级质谱图及中性丢失基团与 文献的比对，鉴定出31种黄酮类成分，见表1。
[0018] 表1裸花紫珠叶黄酮类组分鉴定情况
【主权项】
1. 一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法，其特征在于包括如下步骤： (一） 样品制备： 取裸花紫珠药材，加水浸泡0. 5~2h，煮提1~2h，过滤，药渣再加水煮提1~2h，合并 两次滤液，减压浓缩至相对密度I. 1~I. 3 (60°C);准确称取2~2. 5g于离心管中，加入甲 醇5~10ml，混匀，超声提取0. 5~2h后离心，转速为8000~10000rad/min，取上清液加 入2~2. 5g聚酰胺粉，水浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于砂芯漏斗，纯水洗涤2~4次，每 次5~20ml，再用20~30%%甲醇洗涤2~3次，每次5~20ml，弃去洗涤液，用70~80% 甲醇分3次洗脱,前两次加入甲醇8~IOml,第三次加入甲醇3~5ml,洗脱液加入70%甲 醇定容至25ml,摇匀过膜上机分析； (二） 仪器条件： (1) 液相色谱条件 C18色谱柱；流动相为甲醇和0. 1%的甲酸水溶液，梯度洗脱（0~2min，甲醇75% ;2~ 47min，甲醇 75 % - 45 % ;47 ~52min，甲醇 45 % - 10 % ;52 ~57min，甲醇 10 % ;57 ~ 58min，甲醇 10%- 75% ;58 ~70min，甲醇 75%);流速：0· 2ml/min ;柱温：30° C ;进样体 积：5μ 1 ; (2) 质谱条件 (I) 全扫描电喷雾电离（ESI)，正/负离子方式，扫描范围200 - 1500Μ，扫描时间ls， 分辨率Ql=O. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C，辅助 气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力0u，源内CID电压OV ; (II) 二级质谱扫描电喷雾电离（ESI)，正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Ql=O. 7FWHM，Q3=0. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C， 辅助气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力0u，源内CID电压0V，碰撞气（Ar)压力I. 5mTorr， 碰撞能量15/30eV ; (III) 三级质谱扫描电喷雾电离（ESI)，正/负离子方式，扫描时间0.5s，分辨率 Ql=O. 7FWHM，Q3=0. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加热温度350°C， 辅助气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力Ou，源内CID电压30V，碰撞气（Ar)压力I. 5mTorr， 碰撞能量15/30eV ; (IV) 中性丢失扫描电喷雾电离（ESI)，负离子方式，扫描范围350 - 1500M，扫描时间 0· 6s，分辨率Ql=O. 7FWHM，Q3=0. 7FWHM，喷雾电压4000V，夹套气（N2)压力25psi，毛细管加 热温度350°C，辅助气（N 2)压力2u，离子吹扫气（N2)压力Ou，源内CID电压0V，碰撞气（Ar) 压力I. 5mTorr，碰撞能量15/30eV，中性丢失基团分子量132、146、162、176、308。
2. 根据权利要求1所述的分析鉴定方法，其特征在于，所述步骤(一）样品制备按照下 述方法进行： 取裸花紫珠药材，加15倍量水浸泡30min，煮提2h，过滤，药渣再加15倍量水煮提2h， 合并两次滤液，减压浓缩至相对密度I. 2 (60°C);准确称取2g于离心管中，加入甲醇7ml， 混匀2min，超声提取30min后离心5min，转速10000rad/min，取上清液加入2g聚酰胺粉，水 浴挥干；将挥干的聚酰胺粉置于G3砂芯漏斗，纯水洗涤4次，每次10ml，再用20%甲醇洗涤 2次，每次10ml，弃去洗涤液，用70%甲醇分3次洗脱，前两次加入甲醇10ml，第三次加入甲 醇5ml，洗脱液加入70%甲醇定容至25ml，摇匀过膜上机分析。
【专利摘要】本发明涉及一种裸花紫珠中黄酮类成分的分析鉴定方法。本发明采用液质联用法分析鉴定裸花紫珠中的黄酮类成分，建立了一种快速分析鉴定裸花紫珠中各种黄酮类成分的方法，为裸花紫珠制剂的质量控制提供可行依据。
【IPC分类】G01N30-02, G01N30-06
【公开号】CN104634885
【申请号】CN201310571717
【发明人】颜冬兰, 谷陟欣, 朱丽, 任洁芳, 张妮瑜
【申请人】九芝堂股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月15日