一种使用液相色谱双分子层固定相的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于液相色谱领域，主要涉及对液相色谱方法上的改进，包括提高色谱柱 填料（固定相）的耐受能力，减少对样品预处理的要求以达到节约时间增快检测速度的目 的，同时还降低了对色谱柱前的保护柱的更换频率。
【背景技术】
[0002] 使用液相色谱分离蛋白质，尤其是反相液相色谱，已经有诸多例子。然而由于蛋白 质分子结构复杂，组成各异，一般成功的分离都需要前期进行大量的尝试：例如对固定相的 选择、移动相的选择，对移动相浓度配比进行优化。
[0003] 除此之外，对待分离蛋白质进行提纯的准备工作是必不可少的。由于蛋白质属于 大分子，很可能与固定相发生非特异性结合，导致固定相受到"污染"，甚至导致残留的蛋白 质影响分离。一般的色谱柱都会首先对样品进行预处理，并通过保护柱去除部分污染物，然 而有些蛋白质是研宄者感兴趣的组分不应该被去除，这种方法无疑与研宄目的相悖。若不 进行这些保护工作，则可能导致保护柱或者色谱柱的使用寿命降低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种无论是极性还是非极性固定相都可以尽量避免蛋白 质非特异性结合带来的污染，并且降低对样品预处理的要求，并且提高色谱柱、保护柱的使 用寿命的方法。
[0005] 本发明解决上述问题包括以下方法：
[0006] _制备固定相；
[0007] -使固定相与偶联剂反应，活化固定相表面；
[0008] -选择两性物质⑴及其亲水端被修饰的对等物（Y，即将X修饰后的两性
[0009] 物质），Y可与活化的固定相表面反应固定；
[0010] -根据需要选择对固定相表面进行修饰的极性或者非极性物质（Z，类似于反
[0011] 相色谱固定相的非极性C18)，并且根据需要得出Y与Z的比例，将Y与Z
[0012] 作为反应物与活化的固定相反应。
[0013] _再加入X，形成双分子层。
[0014] _根据稳定性的需要可视情况，在形成了双分子层的固定相颗粒的水混合物
[0015] 中加入甲基丙烯酸酯类的单体，混合充分后进行聚合反应，是双分子层更加
[0016] 稳定。
[0017] -将修饰后的固定相填入到色谱柱中；
[0018] -按照常规方式得出使用色谱柱分离的方法，例如确定流动相、流速等参数。
[0019] -可选的，使用单体，例如甲基丙烯酸酯，聚合式双分子层更稳定。
[0020] 作为优选的实施例，（1)中固定相可以选择二氧化硅、二氧化钛等常规液相色谱固 定相颗粒。
[0021] 作为优选的实施例，（2)中所述两性物质是一端亲油，另一端亲水的分子，并且该 物质形成双分子层。
[0022] 作为优选的实施例，（2)中的两性物质可以由下式表示：
[0023]
【主权项】
1. - 一种使用液相色谱的方法，其特征在于包括以下步骤： -在其固定相表面使用偶联剂活化； -选择可形成双分子层的两性物质X，将其亲水端改性使亲水端可与偶联剂活化后的 固定相表面反应形成化学键，改性后的两性物质为Y ; -根据所要分离物质的极性选择决定固定相表面性质的固定相表面修饰剂Z，该修饰 剂含有可以与偶联剂活化的固定相表面形成化学键的基团； -根据需要将Y，Z按比例混合与固定相反应，使Y，Z覆盖固定相表面； -加入两性物质X，使X，Y形成双分子层； -向含有双分子层的固定相水分散液加入可聚合的单体，充分扩散混合后，进行聚合反 应，分离固定相颗粒后得到结构稳定的含有双分子层的固定相。
2. -根据权利要求1的方法，其特征在于固定相为二氧化硅，偶联剂为γ -氨丙基三乙 氧基硅烷。
3. -根据权利要求1的方法，两性物质X为⑴式定义的化合物：
其中A为P，As，Bi的一种；Q为氧族元素，选自：S，Se，Te，O ;R2, R3相互独立地为6 -20 碳原子的烃基，R1为碳原子数0 - 2的亚烷基，R 4, R5, R6是各自独立的烃基或氢原子，含碳数 为〇 - 3,氮原子电荷随其连接烃基数量而变化。
4. -根据权利要求3的方法，其中A为磷，Q为氧，R4为甲基，R 5, R6为氢原子，R1含碳 数为2的亚烷基。
5. -根据权利要求1的方法，其中物质Y为
两性物质X的R4为甲基，R5, R6是氢原子，其他结构与Y相同。
6. -根据权利要求1的方法，所述可聚合单体为二甲基丙烯酸乙二醇酯和甲基丙烯酸 酯的混合物，聚合反应引发剂为AIBN。
7. -根据权利要求1的方法，固定相表面修饰剂Z为含碳数为20-80的直链脂肪酸。
【专利摘要】本发明涉及一种液相色谱提高分离生物物质使用寿命并且降低分离生物物质样品准备时间和要求的方法。本发明通过对固定相表面进行一系列化学修饰，将通过聚合物稳定的双分子层加入到固定相表面上，这种双分子层不会与生物质例如蛋白质产生非特异性结合，故极大降低了固定相被结构复杂的大分子蛋白质污染吸附的风险。
【IPC分类】G01N30-60
【公开号】CN104655769
【申请号】CN201410797990
【发明人】郭波, 许爱华, 隋峰, 林振强, 孙倩芸, 何云馨, 许思思, 李锋丽
【申请人】山东省计量科学研究院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月19日