一种缺血修饰白蛋白的定量测定方法、试剂及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请涉及一种人体血清中缺血修饰白蛋白的定量测定方法、试剂及试剂盒
【背景技术】
[0002] 缺血修饰白蛋白是在缺血/再灌注发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨 基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合 能力改变的白蛋白。
[0003] 缺血修饰白蛋白能更早发现急性心肌缺血，是检测早期心肌缺血的敏感指标，也 是急性冠脉综合征诊断的生物标志，对脑出血初期、急性冠脉综合征也有指示作用。
[0004] 目前测定缺血修饰白蛋白的方法包括比色测定法、液相色谱法、质谱测定法以及 核磁共振法等。这些方法具有操作繁琐、耗时长、价格昂贵、过度浪费资源的缺点，不适于常 规检验，尤其是大规模流行病学检查或临床大批量标本诸多项目的同时检测。
【发明内容】
[0005] 本申请的目的是提供一种能够应用于大规模临床试验的人体血清中缺血修饰白 蛋白的定量测定方法、试剂及试剂盒。
[0006] 本申请采用了以下技术方案：
[0007] 本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂，该 试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、 氯化钴；所述试剂II含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、二硫基苏糖醇。
[0008] 进一步的，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为30-100mmol/L，磷酸氢二钠含量为 30_100mmol/L，氯化钴的浓度为 5_50mmol/L。
[0009] 进一步的，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为80mmol/L，磷酸氢二钠含量为80mmol/ L，氯化钴的浓度为12mmol/L。
[0010] 进一步的，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为30-100mmol/L，磷酸氢二钠含量为 30-100mmol/L，二硫基苏糖醇含量为 6-12mmol/L。
[0011] 进一步的，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为80mmol/L，磷酸氢二钠含量为 80mmol/L，二硫基苏糖醇含量为10mmol/L。
[0012] 本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂盒， 其中装有上述定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂 I及试剂II组成。
[0013] 本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的方法，该 方法包括向血清样品中加入所述试剂I，37°c孵育5分钟，在一定的波长下测定样品吸光度 Al ;然后向样品中加入试剂II，继续孵育5分钟后在上述波长下测定吸光度A2,由下式（1) 计算ΛΑ样本；用同样的方法测定校准液的吸光度值ΛΑ标准；再通过下式（2)计算得到血 清样品的缺血修饰白蛋白含量：
[0014] Δ A = Α2-Α1 (I)
[0015] 血清中缺血修饰白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ样本V(AA空白-ΛΑ 标准）X标准液浓度（2)
[0016] 本方法的原理为：将血清中白蛋白与CO2+结合后剩余的有力CO2+与有机显色物反 应生成红褐色产物，在510nm的波长下比色，其吸光度与CO 2+浓度成正比，与标准品进行比 较，可计算出样本中白蛋白-钴的值。通过白蛋白-钴的值可计算缺血修饰白蛋白的含量。
[0017] 本发明直接定量测定人血清样品中缺血修饰白蛋白含量的试剂盒，是将分别放置 的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格， 可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。
[0018] 本发明采用的试剂盒及检测方法只需几十微升血清，无需离心或电泳等分离处 理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。
【具体实施方式】
[0019] 实施例一
[0020] 按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II :
[0021] 试剂 I:
[0022] 磷酸二氢钠 80mmol/L
[0023] 磷酸氢二钠 80mmol/L
[0024] 氯化钴 12mmol/L
[0025] 试剂 II :
[0026] 磷酸二氢钠 80mmol/L
[0027] 磷酸氢二钠 80mmol/L
[0028] 二硫基苏糖醇 10mmol/L
[0029] 在样品管中将200 μ 1试剂I和30 μ 1血清样品混合，在37 °C下孵育5分钟，使用 日立7180型全自动生化分析仪，在主波长510nm，副波长700nm处测定吸光度Al，然后向样 品中加入100 μ 1试剂II，混匀，在37°C下孵育5分钟，测定相同波长下的吸光度A2。根据 如下公式（1)计算Λ A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算Λ A标 准。然后根据公式（2)计算得到血清样品的缺血修饰白蛋白含量：
[0030] AA = Α2-Α1 (1)
[0031] 血清中缺血修饰白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ样本V(AA空白-ΛΑ 标准）X标准液浓度 （2)
[0032] 本申请所用标准品为伯乐标准品。
[0033] 实施例二
[0034] 按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II :
[0035] 试剂 I:
[0036] 磷酸二氢钠 30mmol/L
[0037] 磷酸氢二钠 30mmol/L
[0038] 氯化钴 5mmol/L
[0039] 试剂 II :
[0040] 磷酸二氢钠 30mmol/L
[0041] 磷酸氢二钠 30mmol/L
[0042] 二硫基苏糖醇5mmol/L
[0043] 在样品管中将200 μ 1试剂I和30 μ 1血清样品混合，在37 °C下孵育5分钟，使用 雅培C16000型全自动生化分析仪，在主波长510nm，副波长700nm处测定吸光度Al，然后向 样品中加入IOOy 1试剂II，混匀，在37°C下孵育5分钟，测定相同波长下的吸光度A2。根 据如下公式（1)计算Λ A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算Λ A 标准。然后根据公式（2)计算得到血清样品的缺血修饰白蛋白含量：
[0044] AA = Α2-Α1 (1)
[0045] 血清中缺血修饰白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ样本V(AA空白-ΛΑ 标准）X标准液浓度 （2)
[0046] 实施例三
[0047] 按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II :
[0048] 试剂 I:
[0049] 磷酸二氢钠 IOOmmol/L
[0050] 磷酸氢二钠 lOOmmol/L
[0051] 氯化钴 50mmo I /T,
[0052] 试剂 II :
[0053] 磷酸二氢钠 IOOmmol/L
[0054] 磷酸氢二钠 lOOmmol/L
[0055] 二硫基苏糖醇30mmol/L
[0056] 在样品管中将200 μ 1试剂I和30 μ 1血清样品混合，在37 °C下孵育5分钟，使用 奥林帕斯AU400型全自动生化分析仪，在主波长510nm，副波长700nm处测定吸光度Al,然 后向样品中加入100 μ 1试剂Π，混匀，在37°C下孵育5分钟，测定相同波长下的吸光度A2。 根据如下公式（1)计算Λ A样本。用同样的方法和条件测定标准液的吸光度值，并计算Λ A 标准。然后根据公式（2)计算得到血清样品的缺血修饰白蛋白含量：
[0057] AA = Α2-Α1 (1)
[0058] 血清中缺血修饰白蛋白含量（U/mL) = (ΛΑ空白-ΛΑ样本V(AA空白-ΛΑ 标准）X标准液浓度（2)
[0059] 实施例四
[0060] 使用本实施例1中所列的试剂,按照实施例1所述的方法和条件对100例血清样 品的血清中缺血修饰白蛋白含量进行测定，每份血清样品同时以市售血清中缺血修饰白蛋 白含量测定试剂盒（潍坊三维生物工程集团有限公司）进行对照性测定。
[0061] I、SPSS定量统计分析
[0062] I. 1统计描述
[0063]
【主权项】
1. 一种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I 和试剂II组成，其中，所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钴；所述试剂II含有 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、二硫基苏糖醇。
2. 根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为 30-100mmol/L，磷酸氢二钠含量为30-100mmol/L，氯化钴的浓度为5-50mmol/L。
3. 根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂I中磷酸二氢钠含量为SOmmol/ L，磷酸氢二钠含量为80mmol/L，氯化钴的浓度为12mmol/L。
4. 根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为 30-100mmol/L，磷酸氢二钠含量为30-100mmol/L，二硫基苏糖醇含量为6-12mmol/L。
5. 根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂II中磷酸二氢钠含量为 80mmol/L，磷酸氢二钠含量为80mmol/L，二硫基苏糖醇含量为10mmol/L。
6. -种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂盒，其特征在于，其中装有权 利要求1至5中任一所述的定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂，该试剂由分 别放置的试剂I及试剂II组成。
7. -种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的方法，该方法包括向血清样品中加 入所述试剂I，37°C孵育5分钟，在一定的波长下测定样品吸光度A1 ;然后向样品中加入试 剂II，继续孵育5分钟后在上述波长下测定吸光度A2,由下式（1)计算A A样本；用同样的 方法测定校准液的吸光度值A A标准；再通过下式（2)计算得到血清样品的缺血修饰白蛋 白含量： A A = A2-A1 (1) 血清中缺血修饰白蛋白含量卬/11^)=(厶六空白-厶六样本）八厶六空白-厶八标 准）X标准液浓度 （2)。
【专利摘要】本申请涉及一种定量测定人体血清中缺血修饰白蛋白含量的试剂，该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成，其中所述试剂I含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钴；所述试剂II含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、二硫基苏糖醇。本发明采用的试剂盒及检测方法只需几十微升血清，无需离心或电泳等分离处理，操作简便，可满足全自动化分析的要求，适用于大规模样品的及时准确检测。
【IPC分类】G01N21-31, G01N21-78
【公开号】CN104677898
【申请号】CN201510070171
【发明人】梁朝阳
【申请人】浙江凯成生物科技有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月10日