饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种一次性同时测定多种抗菌增效剂的方法，属于药物的检测领域。
【背景技术】
[0002] 四氢叶酸作为一碳转移酶的辅酶，在机体的代谢中发挥着巨大的作用。细菌等 一些病原微生物不能利用外源性的叶酸，需要以对氨基苯甲酸等为底物在二氢叶酸合成 酶的作用下，生成二氢叶酸；再在二氢叶酸还原酶的作用下生成四氢叶酸。磺胺类药物 与对氨基苯甲酸结构相似，可以干扰细菌等病原微生物的二氢叶酸合成。二甲氧苄氨嘧 啶（亦称二甲氧苄啶，diaveridine，DVD，CAS :5355-16-8)、三甲氧苄氨嘧啶（亦称甲氧苄 啶，trimethoprim, TMP，CAS :738-70-5)和二甲氧甲基节氨喃啶（亦称二甲氧甲基节啶， ormetoprim，OMP，CAS :6981-18-6)被称作抗菌增效剂，能抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶 酸不能还原为四氢叶酸，从而妨碍核酸和蛋白质的合成。DVD等与磺胺类药物合用时，可以 从两个不同的环节阻断病原微生物的叶酸合成代谢，使磺胺类药物的疗效显著增强，因此 常与磺胺类药物混合添加于猪、禽饲料中，用于肠道感染的治疗和球虫病的防治。该类药物 还能与其他抗菌药物、抗球虫药物，以及中草药等联用，增强其药效。
[0003] DVD与其他磺胺类药物配伍添加于配合饲料中，仅作为治疗药物用于猪肠道感染 和鸡球虫病的防治，而TMP和OMP则禁止添加于动物饲料中。该类药物理化性质稳定，能通 过食物链在动物体内长期存在而造成危害，农业部公告第235号中对动物性食品中TMP的 最高残留限量（MRL)做了如下规定：牛、猪、禽、鱼，50 μ g/kg;马，100 μ g/kg;日允许摄入量 (ADI)为0~4.2yg/kg。该类药物在广泛应用的同时，许多国家对饲料中该类药物的添加 量有着严格规定。如农业部公告第168号中磺胺喹噁啉二甲氧苄啶预混剂，用于禽球虫病 的治疗，其中DVD在配合饲料中的添加量为20mg/kg ;再如《中国兽药典兽药使用指南一一 化学药品卷》中磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶预混剂，用于猪胃肠道细菌感染和鸡球虫病的 治疗，其中DVD在配合饲料中的添加量为40mg/kg。为了有效地监测和控制饲料中该类药物 的添加量，急需开发一个准确、高效和简便的分析方法。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种准确、高效和简便的同 时一次性分析检测饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的含量 的方法。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
[0006] -种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方 法，使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨 嘧啶在色谱柱上分离，进行串联质谱检测。
[0007] 优选的，所述流动相为甲醇与0. 2%的甲酸水溶液以体积比2:8混合所得。
[0008] 优选的，采用等度洗脱的方式进行色谱柱分离。
[0009] 优选的，色谱分离时，流速为0. 3ml/min，柱温为40°C，进样量为5 μ 1。
[0010] 优选的，所述串联质谱检测的条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管 电压为+4000V，电子倍增器电压增加值为+300V，干燥气温度为350°C，干燥气流速为IlL/ min，进行多重离子反应监测。
[0011] 本发明所分析的饲料样品为配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料。
[0012] 本发明使用的混合酸性流动相等度洗脱，同时使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧 啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C 18色谱柱上分离，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足 一次性同时定性、定量检测饲料样品中多种抗菌增效剂的要求，样品前处理简单，检测结果 准确可靠。不同品种的饲料中，DVD、TMP和OMP的添加量分别为20 μ g/kg时，DVD、TMP和 OMP定量离子的信噪比SNR均大于3 (按照峰高对峰高计），表明方法的检测限可至20 μ g/ kg，即0. 02mg/kg。不同品种的饲料中，DVD、TMP和OMP的添加量分别为40 μ g/kg时，DVD、 TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于10 (按照峰高对峰高计），表明方法的检测限可至 40 μ g/kg，即0. 04mg/kg。不同品种的饲料中，添加不同量的各化合物，回收率均在70%~ 120%的范围内，批内和批间的变异系数均小于20%。具体可参见实施例中的实验分析。
【附图说明】
[0013] 图1为配合饲料中DVD、TMP和OMP的分离色谱图，其中第一个色谱峰为DVD，第二 个色谱峰为TMP，第三个色谱峰为0ΜΡ。
【具体实施方式】
[0014] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015] 实施例1 :
[0016] 一、色谱分离和质谱检测条件
[0017] 色谱柱为 Agilent Eclipse Plus C18(3. OmmX 100mm，1. 8 μπι);在线预过滤芯 (4mm，5 μ m，GRACE，USA)，流动相为甲醇-0· 2 %甲酸水溶液（20:80, v/v)，等度洗脱，流速 0· 3ml/min，柱温 40°C，进样量 5 μ 1。
[0018] 离子源为ESI+，喷雾器压力35psi，毛细管电压为+4000V，电子倍增器电压增加值 (Delta EMV)为+300V，干燥气温度为350°C，干燥气流速为IlIVmin(N2)，进行多重离子反 应监测（MRM)，具体参数见表1。
[0019] 表1各化合物的MRM参数及特征离子对
[0020]
【主权项】
1. 一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法， 其特征在于：使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧 甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离，进行串联质谱检测。
2. 根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨 嘧啶的检测方法，其特征在于：所述流动相为甲醇与0.2%的甲酸水溶液以体积比2 : 8混 合所得。
3. 根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨 嘧啶的检测方法，其特征在于：采用等度洗脱的方式进行色谱柱分离。
4. 根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨 嘧啶的检测方法，其特征在于：色谱分离时，流速为0. 3 ml/min，柱温为40 °C，进样量为5 y 1〇
5. 根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨 嘧啶的检测方法，其特征在于：所述串联质谱检测的条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力35 psi，毛细管电压为+4000 V，电子倍增器电压增加值为+300V，干燥气温度为350 °C，干燥 气流速为11 L/min，进行多重离子反应监测。
【专利摘要】本发明公开了一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法，使用混合酸性流动相进行洗脱，使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离，进行串联质谱检测。本发明使用的混合酸性流动相等度洗脱，同时使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C18色谱柱上分离，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足一次性同时定性、定量检测饲料样品中多种抗菌增效剂的要求，样品前处理简单，检测结果准确可靠。具体可参见实施例中的实验分析。
【IPC分类】G01N30-88
【公开号】CN104678040
【申请号】CN201510062080
【发明人】李剑勇, 杨亚军, 刘希望, 李冰
【申请人】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月5日