生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物处理技术领域，涉及一种生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法。
【背景技术】
[0002]许多研宄证明，通过传统的分离培养方法鉴定的微生物只占天然环境微生物总数的I %。近年来，新兴的宏蛋白质组学是一种运用蛋白质组技术对特定微生物群落所产生的全部蛋白质进行大规模研宄与分析的新技术，也是一种探索微生物群落结构的新策略。通过宏蛋白质组研宄能够把微生物群落组成与其生态功能联系起来，从而更好地了解系统中的功能微生物。
[0003]随着对微生物和环境微生物的宏基因的测序研宄的不断深入和发展，对基因表达蛋白质的研宄更加重要。尽管宏基因组学研宄能够提供很多有价值的数据，其弊端也显现出来:，比如，由于重复基因的出现和基因表达的时空性等原因，造成了微生物的基因表达不能通过宏基因组的研宄来解释。此外，微生物对物质的转化主要是通过其分泌的酶来实现的。众所周知，大多数酶的化学本质是蛋白质，因此，在基因组、转录组、蛋白质组、代谢组这4个研宄层次中，蛋白质组学是最直接的对特定环境和特定时刻生物功能本质的研宄，这种研宄具有较大的生物学意义。尽管现在只开展了少数的宏蛋白质组学研宄，但是其在环境微生物研宄中的巨大作用已经显现出来。
[0004]Wilmes.P.等人在生物强化除磷系统中鉴定出了 702个与A.phosphatis有关的蛋白点，并指出在好氧和厌氧环境下，仅有3%的蛋白表达产生显著差别。Lv.F.等人研宄纤维素的厌氧消化处理时发现微生物能够对纤维素进行剧烈水解作用，并且检测到了分子生物技术未能检出的具有纤维素分解功能的微生物。Kan等人对Chesapeake海湾海水微生物群落进行研宄通过2D电泳发现该海湾不同水域蛋白质组存在较大差异，通过对有表达差异的7种蛋白质谱分析，鉴定出4种新的蛋白质。因此，微生物的蛋白表达是随着时间和空间的变化而变化的动态信息，能够更加直接具体地给出关于微生物活性方面的信息，因而宏蛋白质组学在微生物群落功能分析、代谢与环境相互作用过程中具有更大的潜力。
[0005]进行宏蛋白质组学分析的关键步骤是实现对样品中蛋白质的有效提取。Taylor等模拟天然环境，对培养的微生物样品进行了两种提取方法的比较。结果显示直接提取法的蛋白质SDS-PAGE图像模糊不可辨，而且蛋白质回收率很低；DGC-EXT提取法的SDS-PAGE图像有6?10条带，说明先收集细胞再提取蛋白法(DGCEXT提取法)优于直接提取法。Wilmes.P.等对活性污泥的蛋白质提取进行了不同细胞破碎法、不同洗涤及裂解缓冲液、不同蛋白沉淀及溶解方法对蛋白提取效果的影响的研宄，最终确定了一种适合活性污泥的总蛋白提取方法。Kuhn.R.等人采用了酚提法来提取MBR反应器中活性污泥的蛋白质。苯酚对其中的腐殖质有一定的萃取作用，并对粗提液进行了多次醋酸铵沉淀最终获得了可用于2D电泳分析的蛋白质溶液。由于环境样品的复杂性，目前仍然没有通用的适用于提纯各种环境下微生物总蛋白的方法，尤其是从生物膜或活性污泥等环境中提取蛋白还是有很多的困难。
[0006]对污水污泥处理中微生物的宏蛋白质组学主要集中于活性污泥。然而，在自然环境下，与活性污泥系统相比，生物膜也是个复杂的生态系统，诸多因素共同影响着污染物的迀移、转化以及微生物的群落结构，目前，对于生物膜系统的研宄大都是在实验室可控条件下开展的，需要预先培养或者富集特定微生物。另外，生物膜是复杂的微生物聚集体，食物链长，腐殖化程度明显，生物膜中各种微生物以附着形式生长，在滤料表面繁殖形成致密的生物膜，其结构与微生物种类往往比活性污泥菌胶团更加复杂和多样。而且在生物膜老化的过程中产生的腐殖质会与微生物释放和分泌的蛋白质结合，难以分离导致样品提纯难度大，是这一研宄中存在的最大困难。加上蛋白质技术又没有类似于PCR的扩增手段等，对于蛋白质含量低的样品分析更加困难。现有的各种蛋白质提取方法运用于生物膜效果都不尽人意，目前还没有一种提取生物膜总蛋白质的通用有效的方法，这也是导致宏蛋白质组学在环境研宄方面的迟滞最重要原因。
[0007]目前被宏蛋白质组研宄者广泛使用的由Wilmes.P.建立的方法，发明人重复该方法提取生物膜的蛋白质，没有获得理想的效果，表明该方法缺乏较好的通用性。因此提出了新的高效、通用的蛋白质提取方法对宏蛋白质组学研宄与应用至关重要。
【发明内容】
[0008]为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种生物膜蛋白质的提取方法，该种方法能够对来自于生物膜的蛋白质进行有效提取，其无需对特定的微生物进行预先培养或者富集，同时也能够降低腐殖质对蛋白质的掩蔽作用，使蛋白质能够很好地与腐殖质相脱离。
[0009]本发明的另外一个目的在于提供一种电泳样品的制备方法，该方法采用上述被提取后的蛋白质制成电泳样品，能够使得该电泳样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测后所成的条带清晰，或者，使该电泳样品经双向电泳(two-dimens1nalelectrophoresis)分离后所成的蛋白质点清晰，为蛋白质组学研宄等后续的研宄工作打下了良好的基础。
[0010]为达到上述目的，本发明的解决方案是:
[0011]一种生物膜蛋白质的提取方法，其包括如下步骤:
[0012](I).对生物膜样品进行预处理，得到沉淀物；
[0013](2).将步骤(I)所得沉淀物与裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在冰浴条件下超声裂解，得到样品裂解液；
[0014](3).将步骤⑵所得样品裂解液震荡并离心，取上清液，采用TCA-丙酮沉淀法对上清液进行处理，得到蛋白质样品。
[0015]其中，步骤(I)中的预处理包括如下步骤:
[0016]a.采用浓度为9 土 lmg/mL的氯化钠溶液洗涤生物膜样品，以8000 土 100rpm的转速于4±1°C下离心5±lmin，收集沉淀；
[0017]b.采用磷酸缓冲盐溶液洗涤步骤a所得沉淀，涡旋振荡后以8000 土 100rpm的转速于4±1°C下离心5±lmin，得到沉淀物。
[0018]在步骤(2)中，裂解液可以含有1±0.5界七％的Triton X_100、l±0.5wt%的脱氧胆酸钠和 0.1±0.05wt%^ SDSo
[0019]在步骤⑵中，苯甲基磺酰氟溶液的浓度可以为100±10mmol/L，超声的强度可以为250-300W，超声的时间可以为20±10个周期，每个周期内连续超声20秒并且停止超声10秒。
[0020]在步骤(3)中，震荡的条件可以为:以200-300rpm的速度于4土1°C下进行震荡；离心的条件可以为:以13000± 100rpm的转速于4±1°C下离心30±10min。
[0021 ] 在步骤(3)中，TCA-丙酮沉淀法可以包括如下步骤:
[0022]a.将上清液与三氯乙酸以(9±3): (I ± I)的体积比混合，于4土 1°C下静置，然后离心，得到初级沉淀物；
[0023]b.将步骤a所得初级沉淀物用三倍于初级沉淀物体积的预冷后的丙酮洗涤，于4±1°C下静置并离心，得到次级沉淀物；
[0024]c.重复步骤b两至三次，得到蛋白质样品。
[0025]其中，在步骤a中，静置的时间可以为30±10min，离心的条件可以为:以13000± 100rpm 的转速于 4±1°C下离心 10±5min。
[0026]在步骤b中，静置的时间为30±10min，离心的条件为:以13000±1000rpm的转速于 4± 1°C下离心 10±5min。
[0027]一种电泳样品的制备方法，其包括如下步骤:使用溶解液溶解上述的蛋白质样品，依次进行超声、涡旋振荡和离心，取上清液得到电泳样品。
[0028]其中，溶解液中含有7mol/L的尿素和2mol/L的硫脲。超声的时间可以为20±5min ;涡旋振荡的时间可以为30min以上；离心的条件可以为以13000± 100rpm的速度于4± 1°C下离心30± 1min。
[0029]由于采用上述方案，本发明的有益效果是:
[0030]首先，本发明采用含有多