羟丙基壳聚糖取代度的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种测定羟丙基壳聚糖取代度的方法，具体涉及用吸光光度法测 定羟丙基壳聚糖取代度的方法尤其涉及其测定过程中反应温度、反应时间和检测波长的选 择。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、稳定性、安全性，但其低水溶性大 大限制了其在生物制药、废水处理、功能膜材料和纺织等领域的应用。羟丙基化能改善壳聚 糖的水溶性，进而提高其在各方面的应用。羟丙基取代度（DS)定义为每个氨基葡萄糖和 N-乙酰氨基葡萄糖分子上连接的羟丙基的平均数量。取代度的大小决定羟丙基壳聚糖的溶 解性、吸湿性、保湿型、成膜性等物化特性及其在医药领域的相关应用，因此取代度的测定 方法研宄是羟丙基壳聚糖研宄中的一项基本工作。
[0003] 目前已报道的用于羟丙基壳聚糖取代度的测定方法有吸光光度法、核磁共振氢谱 法、元素分析法，其中吸光光度法成本最低，吸光光度法测羟丙基壳聚糖取代度的原理是利 用羟丙基壳聚糖在浓硫酸的作用下醚键、N-C键断裂，羟丙基基团脱落并被氧化为丙醛或丙 烯醇，两种化合物均可与茚三酮反应并形成紫色络合物，通过测定此显色产物的吸光度值 即可定量计算羟丙基壳聚糖中羟丙基基团的含量，此测定方法的关键在于显色产物的生 成及其吸光度值的测定。已报道文献中所用的吸光光度法是直接套用羟丙基淀粉取代度的 测定方法，即：将羟丙基壳聚糖与浓硫酸在l〇〇°C水浴下反应3min，随即将氧化产物置于冰 水浴环境中冷却至l〇°C以下，加入一定量茚三酮溶液25°C下显色反应lOOmin，显色完成后 用浓硫酸定容，于590nm下测定显色产物吸光光度值，同样的操作步骤以丙二醇为底物制 作标准曲线，根据标准曲线与羟丙基壳聚糖显色产物吸光度值即可得到羟丙基取代度值。
[0004] 在具体实验中发现按上述操作参数进行实验得到的结果重现性、稳定性较差。首 先100°C沸水浴环境不利于人工操作，且此温度下反应产物对反应时间的变化极其敏感，反 应时间稍微延长或缩短即会影响反应产物的量（见附图1-3)，这对操作人员在实验中对反 应时间的把控要求非常高，极不利于获得准确可靠的实验结果，造成重现性差；另外，590nm 检测波长下，显色产物吸光度值极不稳定，随着检测时间的延长，吸光度值呈明显的下降趋 势（见附图4-6)，即使两次检测时间间隔20min，吸光度值也会发生较明显的变化，同样不 利于获得准确可靠的实验结果，更不利于工业大批量测定。
[0005] 综上所述，现有的吸光光度法在准确度及大规模应用上均存在较大的问题，不利 于方法的推广与使用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的为解决现有方法中存在的问题，提供一种利用待测羟丙基壳聚糖水 解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量的取 代度测定方法羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量。
[0007] 吸光光度法测定羟丙基壳聚糖取代度包括以下步骤：
[0008] -种羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征是：
[0009] A.制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应 关系曲线；
[0010] B.用吸光光度值检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光 度值；
[0011] C.根据上一步骤制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应 关系曲线确定待测羟丙基壳聚糖水解产生的相当于丙二醇的含量，以此来计算羟丙基壳聚 糖中所含的羟丙基含量。
[0012] 优化的，上述步骤A的具体步骤是：分别取11组具有不同浓度的丙二醇标准溶液 0. lmL，浓度范围在0-247 y g/mL之间，冰水浴环境中加入0. 8mL浓硫酸，混匀，于80°C水浴 加热5-8min后立即置于冰水浴冷却，加入0. 05mL茚三酮溶液，将0. 75g水合茚三酮溶解于 50mL12. 5%的亚硫酸氢钠水溶液中，混勾，于25°C水浴显色lOOmin后加入1. 55mL浓硫酸， 充分混匀，于波长540-560nm处测定吸光度值；根据每组丙二醇浓度与测得的吸光度值之 间的关系绘制标准对应关系曲线。
[0013] 优化的，上述步骤B的具体步骤是：分别取不同浓度的羟丙基壳聚糖溶液0. lmL， 其浓度为〇. 4-1. 2mg/mL，冰水浴环境中加入0. 8mL浓硫酸，混勾，于70°C水浴加热l_3min 后立即置于冰水浴冷却，加入0. 05mL萌三酮溶液，混勾，于25°C水浴显色lOOmin后加入 1. 55mL浓硫酸，充分混匀，于波长540-560nm处测定吸光度值。根据步骤A制作的丙二醇浓 度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定羟丙基壳聚糖中羟丙基的含 量，以此来计算羟丙基壳聚糖的取代度；羟丙基壳聚糖的取代度定义为每个氨基葡萄糖或 N-乙酰氨基葡萄糖分子上所连接的羟丙基的平均数量。
[0014] 优化的，上述丙二醇标准溶液、羟丙基壳聚糖溶液以0. 005-0. 010m〇l/L的盐酸溶 液为溶剂。
[0015] 优化的，以丙二醇为反应物的反应条件是80°C，6min。
[0016] 优化的，上述以羟丙基壳聚糖为反应物的反应条件是70°C，2min。
[0017] 优化的，上述测定吸光度值的最佳波长范围为550nm-555nm。
[0018] 优化的，步骤C的具体方法是：将步骤B中获得的每个样品浓度的吸光度值代入步 骤A中丙二醇浓度与显色产物吸光度值之间的标准对应关系曲线，得到待测羟丙基壳聚 糖样品在反应过程中产生的相当于丙二醇的含量，代入以下公式来计算羟丙基壳聚糖中所 含的羟丙基含量：
[0019]
【主权项】
1. 一种羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述测定方法的步骤为： A. 制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应关系 曲线； B. 用吸光光度值检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度 值； C. 根据上一步骤制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系 曲线确定待测羟丙基壳聚糖水解产生的相当于丙二醇的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖中 所含的羟丙基含量。
2. 根据权利要求1所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述步骤A的 具体步骤是：分别取11组具有不同浓度的丙二醇标准溶液〇.lmL，浓度范围在0-247yg/mL 之间，冰水浴环境中加入〇. 8mL浓硫酸，混匀，于80°C水浴加热5-8min后立即置于冰水浴冷 却，加入0. 05mL茚三酮溶液，将0. 75g水合茚三酮溶解于50mL12. 5 %的亚硫酸氢钠水溶液 中，混匀，于25°C水浴显色lOOmin后加入1. 55mL浓硫酸，充分混匀，于波长540-560nm处测 定吸光度值；根据每组丙二醇浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。
3. 根据权利要求1或2所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述步 骤B的具体步骤是：分别取不同浓度的羟丙基壳聚糖溶液0.lmL，其浓度为0. 4-1. 2mg/mL， 冰水浴环境中加入0. 8mL浓硫酸，混匀，于70°C水浴加热l_3min后立即置于冰水浴冷却，加 入0. 05mL茚三酮溶液，混匀，于25°C水浴显色lOOmin后加入1. 55mL浓硫酸，充分混匀，于 波长540-560nm处测定吸光度值。根据步骤A制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度 值之间的标准对应关系曲线确定羟丙基壳聚糖中羟丙基的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖 的取代度；羟丙基壳聚糖的取代度定义为每个氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖分子上所 连接的羟丙基的平均数量。
4. 根据权利要求3所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述丙二醇 标准溶液、羟丙基壳聚糖溶液以〇. 005-0. 010m〇l/L的盐酸溶液为溶剂。
5. 根据权利要求3所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述丙二醇 为反应物的反应条件是80°C，6min。
6. 根据权利要求3所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述羟丙基 壳聚糖为反应物的反应条件是70°C，2min。
7. 根据权利要求2和3所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述测定 吸光度值的最佳波长范围为550nm-555nm。
8. 根据权利要求1所述的羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述步骤C的 具体方法是：将步骤B中获得的每个样品浓度的吸光度值代入步骤A中丙二醇浓度与显色 产物吸光度值之间的标准对应关系曲线，得到待测羟丙基壳聚糖样品在反应过程中产生的 相当于丙二醇的含量，代入以下公式来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量：
式中c丙二醇为样品产物吸光度值所对应的丙二醇溶液浓度，ymol/mL;V为该样品溶 液的体积，mL;m为样品中羟丙基壳聚糖的质量，mg;58. 08、203. 19、161. 16分别为羟丙基基 团、N-乙酰氨基葡萄糖残基、氨基葡萄糖残基的摩尔质量，g/mol;DA为羟丙基壳聚糖中每 100个糖残基中所含有的乙酰基个数，DA%则为乙酰化度，％ ;0. 94为校正系数。
【专利摘要】本发明公开了一种吸光光度法测羟丙基壳聚糖取代度的方法，其特征是：A.制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应关系曲线；B.用吸光光度值检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值；根据上一步骤制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测羟丙基壳聚糖水解产生的相当于丙二醇的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量。本发明中关键参数如反应温度、反应时间、检测波长的选择，大大提高了测定的稳定性，使显色产物吸光度值的稳定性由之前已报道的方法中不到0.5小时提高到3小时，使之更便于大批量测定，从而保证实验结果的准确性。
【IPC分类】G01N21-31
【公开号】CN104697944
【申请号】CN201410841212
【发明人】张永勤, 张坤, 刘福胜, 刘征东, 程袁芬, 吴国耀, 刘均洪, 戴圆圆, 边文涛
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年12月30日