抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种临床检测试剂制备方法，具体为抗凝血酶III活性测定试剂盒的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗凝血酶111(&11衍让1'〇1111^1111141'111)是凝血酶及因子乂11(1、乂1(1、1乂(1、父(1 等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合。形成ATIII 凝血酶复合物而使酶灭活，肝素可加速这一反应达千倍以上。肝素与ATIII所含的赖氨酸 结合后引起ATIII构象改变，使ATIII所含的精氨酸残基更易与凝血酶的丝氨酸残基结 合。一旦肝素-ATIII凝血酶复合物形成，肝素就从复合物上解离，再次与另一分子ATIII 结合而被反复利用。ATIII-凝血酶复合物则被网状内皮系统所消除。大量相关文献已经 证明，临床上血浆中AT-III的活性变化与多种疾病密切相关。AT-III的增多或减少是出 血、血栓的关键，它在肝病、肾病、肺病、肿瘤、DIC、妊娠高血压综合征等疾病的诊断中具有 重要意义，对脑梗、心梗等突发疾病的协助诊断方面尤显重要。因此，AT-III活性检测在临 床上具有良好的应用前景。
[0003]ATIII发色底物法检测原理是在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶与血浆中 ATIII形成1 : 1复合物，剩余的凝血酶作用于发色底物，裂解出显色基团，显色程度与剩 余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中ATIII活性呈负相关。在临床研宄中应用越来越广泛。 目前进口的AT-III发色底物法活性的试剂盒已有供应，但价格昂贵。因此，研宄开发价格 合理、特异性和灵敏度较高的国内自主品牌的AT-III活性检测试剂盒对于提高AT-III临 床诊断水平具有重要意义和价值。
[0004] 专利CN102690862A，公开了一种抗凝血酶III测定试剂盒（发色底物法），由于 采用了肝素衍生物和进口的凝血酶，因此成本比较高。并且该现有技术在全自动凝血仪上 进行ATIII活性检测时需要更改参数，更改的参数为待测血浆5y1，加入120y1稀释液后 再取50y1血浆和60y1R1试剂，再加入60y1R2试剂，最后进行显色。此外在后台参数的 设计上，需要更改参数光量设置，机器自身在检测中设置的参数光量值为"200-400"，在检 测的过程中需要将"200 "改为"0"。该技术由于成本比较高，因此减少了试剂的用量，体积 的缩小可能会引起最后在比色的过程中部分的数值不能显示。因此，将参数光量值设置调 整为了 "0"。该技术成本较高，并且操作不方便，结果也容易出现误差。
【发明内容】
[0005]针对上述技术问题，本发明提供一种制备ATIII活性检测试剂盒的方法。制备得 到的产品成本低，稳定性好，可配套用于多种凝血仪使用，满足临床对于ATIII活性检测的 要求。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案，
[0007] 抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)使用PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl溶液将凝血酶冻干粉末和肝素钠溶 解，配制成S1试剂，S1试剂的凝血酶浓度为5~20IU/mL，肝素浓度为0. 2~10IU/mL;
[0009] (2)将发色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PHL0 的 10 ~ 50mm〇l/LTris-HCl溶解，配制成底物浓度为2~5ymol/mL的溶液，为S2试剂；
[0010] (3)分别在S1试剂和S2试剂中加入助剂进行冻干，形成S1冻干品和S2冻干品；
[0011] S1试剂加入的助剂在S1试剂中的含量为：BSA为0. 5~5%，KC1浓度为15~ 250mmol/L、EDTA2K浓度为1~10mmol/L、抑肽酶0? 1~5IU/mL、聚乙二醇6000浓度为1~ 5mg/ml；
[0012] S2试剂加入的助剂在S2试剂中的质量比例为：BSA为0. 5~5%、甘露醇为1~ 5% ；
[0013] (4)使用含有PH8. 4 的 10 ~50mmol/LTris-HCl、0. 1 ~0? 5mg/ml叠氮化钠的S1 试剂复溶液复溶S1冻干品，配制成S1冻干复溶试剂；使用超纯水溶解S2冻干品，配制成S2 冻干复溶试剂；
[0014] (5)采取新鲜多人份混合血浆，加入稳定剂、防腐剂物质进行冻干，制备得到 ATIII校准品；
[0015] 采用WH0/BS/10. 2146标准品，在全自动凝血仪CA-1500上对ATIII校准品进行定 值，定值范围ATIII%为90%~110%;
[0016] (6)在全自动凝血仪CA-1500上，采用定值的ATIII校准品、S1冻干复溶试剂和S2 冻干复溶试剂制作标准曲线，线性相关系数大于〇. 99;
[0017] (7)使用待测血浆样品在全自动凝血仪CA-1500上进行检测，检测得到待测血浆 样本的0D值，机器自动计算出待测血浆样本中ATIII的活性值，检测程序如下：16y1待测 血浆样品中加入175ylS1冻干复溶试剂和33ylS2冻干复溶试剂后进行显色反应，整个 过程不调整仪器自身的任何参数。
[0018] 本发明提供抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，制备得到的试剂盒成本 低，线性范围宽达到200 %~3. 1 %，稳定性好，在全自动凝血仪器上检测不需要更改任何 参数，操作简单，可配套用于多种凝血仪使用，满足临床对于ATIII活性检测的要求。
【具体实施方式】
[0019] 结合实施例，进一步阐述本发明：
[0020] 实施例以制备ATIII活性检测试剂以及具体在全自动凝血仪CA-1500上检测为 例。
[0021] (1)使用10~50mmol/LTris-HClPH8. 4溶液将凝血酶冻干粉末和肝素钠溶解， 将不同浓度的凝血酶和肝素钠溶液进行混合，配制成S1试剂，凝血酶浓度为5~20IU/mL， 肝素浓度为〇. 2~10IU/mL。
[0022] (2)将发色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PHL0 的 10 ~ 50mm〇l/LTris-HCl溶解，配制成底物浓度为2~5ymol/mL的溶液，为S2试剂。
[0023] (3)分别在S1试剂和S2试剂中加入稳定剂和赋形剂进行冻干，即可制备成S1 冻干品和S2冻干品。S1试剂加入的助剂在S1试剂中的含量为：0. 5%~5%BSA，20~ 50mmol/LTris-HCl，15 ~250mmol/LKC1、1 ~10mmol/LEDTA2K/L、0. 1 ~5IU/mL抑肽酶、 1~5mg/ml聚乙二醇6000 ;。S2试剂加入的助剂在S2试剂中的质量比例为：BSA为0. 5~ 5%、甘露醇为1~5%。
[0024] (4)使用含有PH8. 4 的 10 ~50mmol/LTris-HCl、0. 1 ~0? 5mg/ml叠氮化钠的S1 试剂复溶液复溶S1冻干品，配制成S1冻干复溶试剂；使用超纯水溶解S2冻干品，配制成S2 冻干复溶试剂。
[0025] (5)在CA-1500上，使用定值好的ATIII校准品制作标准曲线，制作的标准曲线线 性相关系数大于0. 99。
[0026] (6)使用待测血浆样品在全自动凝血仪CA-1500上进行检测，检测得到样本的0D 值，机器自动计算出待测样本中ATIII的活性值，检测程序如下：16wl血浆中加入175y1 S1冻干复溶试剂和33y1S2冻干复溶试剂后进行显色反应，整个过程不调整仪器自身的任 何参数。
[0027]广品性能检验测试：
[0028] (1)在全自动凝血仪器上的检测结果
[0029] 用SysmexCA-1500全自动血凝仪及配套抗凝血酶III检测试剂（SIEMENS)和本 实施例制的的ATIII检测试剂制作标准曲线，结果见表1。
[0030] 表1ATIII标准曲线制作结果
[0031]
【主权项】
1.抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 使用PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl溶液将凝血酶冻干粉末和肝素钠溶解，配 制成S1试剂，S1试剂的凝血酶浓度为5~20IU/mL，肝素浓度为0. 2~10IU/mL; (2) 将发色底物S-2238 或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用PH7. 0 的 10 ~50mmol/ LTris-HCl溶解，配制成底物浓度为2~5ymol/mL的溶液，为S2试剂； (3) 分别在S1试剂和S2试剂中加入助剂进行冻干，形成S1冻干品和S2冻干品； S1试剂加入的助剂在S1试剂中的含量为：BSA为0. 5~5 %，KC1浓度为15~250mmol/L、EDTA2K浓度为1~10mmol/L、抑狀酶0. 1~5IU/mL、聚乙二醇6000浓度为1~5mg/ml; S2试剂加入的助剂在S2试剂中的质量比例为：BSA为0. 5~5%、甘露醇为1~5% ; ⑷使用含有PH8. 4的10~50mmol/LTris-HCl、0. 1~0? 5mg/ml叠氮化钠的S1试剂 复溶液复溶S1冻干品，配制成S1冻干复溶试剂；使用超纯水溶解S2冻干品，配制成S2冻 干复溶试剂； (5) 采取新鲜多人份混合血浆，加入稳定剂、防腐剂物质进行冻干，制备得到ATIII校 准品； 采用WH0/BS/10. 2146标准品，在全自动凝血仪CA-1500上对ATIII校准品进行定值， 定值范围ATIII%为90%~110% ; (6) 在全自动凝血仪CA-1500上，采用定值的ATIII校准品、S1冻干复溶试剂和S2冻 干复溶试剂制作标准曲线，线性相关系数大于〇. 99 ; (7) 使用待测血浆样品在全自动凝血仪CA-1500上进行检测，检测得到待测血浆样本 的0D值，机器自动计算出待测血浆样本中ATIII的活性值，检测程序如下：16y1待测血浆 样品中加入175ylS1冻干复溶试剂和33ylS2冻干复溶试剂后进行显色反应，整个过程 不调整仪器自身的任何参数。
【专利摘要】本发明涉及一种临床检测试剂制备方法，具体为抗凝血酶III活性测定试剂盒的制备方法，Tris-HCl溶解凝血酶冻干粉末和肝素钠制成S1试剂，将凝血酶发色底物S-2238或Sar-Pro-Arg-P-nitroanilide用Tris-HCl溶解制成S2试剂，S1试剂和S2试剂冻干形成S1冻干品和S2冻干品；含Tris-HCl叠氮化钠溶液复溶S1冻干品配制成S1冻干复溶试剂；超纯水溶解S2冻干品制成S2冻干复溶试剂；多人份混合血浆进行冻干，制备得到ATIII校准品；对ATIII校准品进行定值，定值范围ATIII％为90％～110％；采用定值的ATIII校准品、S1冻干复溶试剂和S2冻干复溶试剂制作标准曲线，线性相关系数大于0.99；待测血浆样品中加入S1冻干复溶试剂和S2冻干复溶试剂后进行显色反应。该方法制备得到的试剂盒成本低，线性范围宽，稳定性好，操作简单。
【IPC分类】G01N33-86
【公开号】CN104714036
【申请号】CN201510151571
【发明人】肖薇, 林方昭, 谢兆林, 杨显福, 孙小成, 肖玲
【申请人】成都协和生物技术有限责任公司, 中国医学科学院输血研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年4月1日