评价内体运输的测定的制作方法

文档序号:8399233阅读:339来源:国知局
评价内体运输的测定的制作方法
【专利说明】评价内体运输的测定
[0001] 本发明设及用于评价分子递送到真核细胞内的效率的测定和相应试剂盒。
[0002] 任何潜在治疗分子发挥功效的关键要求是其必须能够表现出良好的效能。本发明 设及经由熟知的内吞过程进入真核细胞胞质的分子。鉴于此,重要的是理解该细胞进入模 式所设及的步骤。因而,为了帮助例示与该细胞进入模式相关的关键步骤,可参考图1。在 步骤1中,分子与细胞表面上存在的结合位点(例如受体或接受体)结合。在步骤2中,受 体(加上结合的分子)变成内化到细胞中-该步骤通称为"内吞"或"内体形成"。在步骤 3中,在内化之后,分子插入内体膜,并实现所述分子(或其一部分)从内体内、穿过内体膜 和进入真核细胞胞质的释放。一旦在胞质中(步骤4),所述分子能够作用于其胞内祀(例 如抑制祀分子,如蛋白水解切割细胞祀蛋白)。
[0003] 因此良好效能测试有赖于准确评价一个或多个上述步骤。
[0004] 迄今为止,对能够经由"受体介导的内吞"进入真核细胞的分子的效能测试集中在 毒性分子如梭菌神经毒素。举例而言,W下测定已被用于市售的梭菌神经毒素(例如肉毒 杆菌神经毒素,其市售名诸如Dysport?,Neurobloc?和Botox?)。
[0005] 小鼠LDg。测定是目前唯一经抑A批准用于发布肉毒杆菌毒素的测定。该测定同时 测试肉毒杆菌神经毒素的所有=个结构域的作用(即结合、易位和蛋白酶)。更具体而言, 其限定该毒素在限定时间点(通常在给药后2-4天)的半数致死腹膜内剂量(活性W小鼠 LDg。单位表示)。然而令人遗憾的是,LD5。测定使用大量动物。而且,LD5。单位不是绝对测 量值,因为其不是生物学常数-由此其高度取决于测定条件。特别是,伴随该测定的误差在 不同测试设施间可W高至 60%(Sesardicetal.2003 巧iologicals31(4):265-276)。
[0006] 小鼠弛缓性麻搏测定,也称为"小鼠腹下垂测定",将肉毒杆菌毒素的活性与将毒 素皮下注射到小鼠左腹股沟下肢区域后看到的腹部凸出程度相关联-麻搏大小程度是剂 量依赖性的。该方法被提出作为小鼠LDg。测试的改进,因为其建立在人道的终点上。该测 定比LDg。测定更敏感约10倍,使用亚致死剂量的毒素,且比LDW测试更迅速-其在24-48 小时提供结果,相比于典型LDg。测定的72-96小时。来自该测定的结果显示出与LDW值优 异的一致性(Sesardicetal.,1996)。尽管该测定使用LD日。测定中所用动物的20%,其仍 然必需使用动物。
[0007] 诸如小鼠/大鼠隔神经半隔测定(其基于使用离体神经肌肉制备物)的测定将 肉毒杆菌神经毒素的活性与将其应用于维持培养基后所述制备物抽动反应幅度的下降相 关联。该测定的通常终点是观察到幅度下降50%前所需的时间。但是遗憾的是,半隔测定 (象LDg。测定)导致使用大量动物。此外,该测定需要培训过使用复杂且昂贵设备的高技 能人员。
[000引使用培养脊髓神经元的底物切割测定将肉毒杆菌神经毒素的活性与对所述神经 元中存在的特异性蛋白质的切割相关联。尽管该测定比体内江町。,小鼠弛缓性麻搏)和离 体测定(半隔)使用较少的动物,所述测定需要高技能人员来进行解剖和培养-解剖和培 养技术是耗时的且必须在需要进行前~3周计划。另一个缺陷是底物切割测量值可W是高 度可变的。
[0009] 所有上述测定都具有特定的缺点,尤其是动物福祉问题和/或限制于测试与神经 肌肉接头(NMJ)结合的分子-后者是天然梭菌神经毒素结合的祀细胞。
[0010] W095/33850描述了一种无细胞底物切割测定,其中通过表位特异性抗体来检测切 割产物。由于所述抗体能够区分经切割的底物和未切割底物蛋白,有可能定量梭菌神经毒 素的效能。尽管该测定没有上述动物福祉或NMJ特异性不足,其实际上是"无细胞"测定且 由此仅仅能够评价在蛋白质切割方面的效力。相应地,W095/33850不能评价在任何一个或 多个同等重要的步骤方面的效能,尤其是;细胞结合;内体形成;或穿过内体膜易位。换言 之,(根据W095/33850)鉴别为有效的底物切割分子的分子可能具有极少或没有有用的治 疗效能-例如由于其缺乏W下任何一种或多种;最佳的细胞结合;最佳的内体形成;和/或 最佳的易位功能。
[0011] 因此本领域需要替代和/或改进的效能测定,其解决一个或多个上述问题。例如, 需要解决现存的动物福祉问题的人道性测定。类似地,不限于测试特异性结合NMJ和/或 神经元细胞的分子的测定。类似地,需要提供可靠的分子效能结果的测定,特别是提供反映 体内效能的效能结果的测定。
[0012] 本发明通过提供一种测定解决了上述问题,其包括:
[0013] i)使真核细胞与有待评价内体释放能力的测试分子接触,其中所述真核细胞包含 细胞膜,其包括存在于所述细胞细胞膜外表面上的结合位点;
[0014] ii)使测试分子与所述真核细胞温育,并由此允许
[0015] a)测试分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物,从而允许所 述结合复合物通过内吞进入真核细胞;
[0016] b) -个或多个内体在所述细胞之内形成,其中所述一个或多个内体含有测试分 子;和
[0017] C)所述测试分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真核细胞的胞 质;
[0018] iii)除去未与存在于真核细胞上的结合位点结合的过量测试分子;
[0019] iv)在预定时间段后,检测存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量,或者检 测存在于所述真核细胞的胞质中的测试分子的量;
[0020] V)将步骤iv)中检测到的测试分子的量与对照值相比较,其中所述对照值代表在 步骤iv)之前存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量或存在于胞质中的测试分子 的量;
[0021] Vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的测试分子的量的相对变化,或者 通过确定存在于所述真核细胞胞质中的测试分子的量的相对变化,计算测试分子的内体释 放值。
[0022] 所述真核细胞可选自酵母细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、植物细 胞和真菌细胞。该类动物细胞的实例包括人类、晒齿类、小鼠和仓鼠细胞。
[0023] 在一个实施方案中,所述真核细胞结合位点能够实现受体介导的内吞或者非受 体介导的内吞。所述结合位点可W是受体或接受体。经由非受体结合位点内吞的肤序列 的实例包括具有富含精氨酸的序列(例如RRRRRRRR,RRRRRRRW)的肤,和诸如W下的肤: PHLIP,P巧-1,SAPE,PFVYLI,和KaposiFGF衍生AAVALIPAVILALLAP。该些肤据信经由非特 异性离子相互作用被内吞如细胞。所述结合位点可w是在真核细胞细胞表面上天然存在的 结合位点。或者,真核细胞可W是经修饰W表达不会天然存在于所述真核细胞细胞表面上 的结合位点的重组真核细胞。
[0024] 温育步骤U)可^进行任意给定时间段,例如从5分钟到5天的时间段。典型的 时间段是1-12小时,例如2-10小时,4-8小时,或6-8小时。在此期间,真核细胞(即细胞 膜的外表面)暴露于测试分子(典型地是过量的测试分子),结果实现"稳态",其中测试分 子W大致相同的速率进入并离开胞内的内体。该一时间点代表进行步骤iii和/或iv)的 最佳时间点。
[0025] 步骤iii)设及减少或去除真核细胞外的测试分子来源,从而减少进入细胞的测 试分子的量(或实质上防止测试分子进入细胞)。所述进入真核细胞的测试分子的量的减 少继而提供进入内体的测试分子的量的改变,其继而导致离开内体和/或进入真核细胞胞 质的测试分子的量(或速率)的改变。正是离开内体结构的测试分子的量(或速率)提供 了本发明测定的基础-所述测试分子离开内体结构的量(或速率)可W通过存在于内体中 的测试分子的量的变化和/或通过存在于胞质中的测试分子的量的变化来衡量。当测量存 在于内体中的测试分子的量时,通常观察到存在的测试分子的量的减少。当测量存在于胞 质中的测试分子的量时,可观察到存在于胞质之中的测试分子的量的增加或减少。举例而 言,当在建立测试分子的稳态内体运输之前启动步骤iii)时,可观察到胞质中的测试分子 的量的增加。或者,当测试分子从真核细胞的细胞分泌速率超过测试分子内体运输从内体 进入胞质中的速率时,可观察到胞质中的测试分子的量的减少。
[0026] 测定中所用的真核细胞可固定在表面上。细胞的固定可作为测定前步骤进行(即 预固定),或者可W作为测定规程的一部分来进行。因此,在一个实施方案中,对测定的细胞 进行预固定。
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