酸性条件下分析物测定用方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及流体样品中分析物总浓度的测定，其中分析物可至少部分为复合体形 式，典型地作为免疫复合体。更具体地，本发明涉及其中预形成的分析物复合体在测定分析 物之前解离的测定方法，W及用于进行该方法的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 为了可靠地进行免疫测定，不受限制地接近于祀分子，或者说分析物上的所选表 位，如由所选抗体限定的，是定量测定分析物所必需的。如果能够在生理条件下彼此相互作 用的两种W上的不同蛋白质已形成复合体，则较低浓度的组分将取决于两种反应物的相互 作用性质和浓度而部分地W与配对物的复合形式出现。由于用于测定的某些表位可能被隐 藏在复合体中，该可证明特别是对浓度较低的配对物的定量是不利的。
[0003]某些类型的蛋白质可形成同-多聚体化omo-multimer)，例如成原纤维的蛋白(fibrillatingproteins),其中测定必需的关键表位不会完全易接近于蛋白聚集体。如果 单体具有有限数目的表位，则该可能导致当多聚化倾向于发生时低估单体蛋白浓度（1)。
[0004] 为了保持稳态，可W预定比例在活性酶及其抑制剂之间形成蛋白复合体，使酶的 精确测定复杂化。该可导致在免疫测定中难W接近某些表位，并因而免疫测定可产生不准 确的浓度估计（2)。
[0005] 由于如也肌细胞（3)或肿瘤细胞（4)的细胞损伤造成的在较长一段时间内的细胞 内蛋白间歇式释放可产生对细胞内蛋白的免疫应答。该些可在后期导致由祀分子和自身抗 体组成的免疫复合体的形成。考虑到免疫系统的放大性质，可形成与祀蛋白相比相对浓度 高得多的抗体，导致免疫复合体的形成，而使祀蛋白的精确定量复杂化。
[0006] 上述实例代表祀分析物的定量可产生与真实祀分析物值有显著偏差的状况，通常 大大低估了真实的浓度。
[0007] 再者，在生物化学纯化过程中可发生类似的现象。近年来，全新种类的疗法，重组 单克隆抗体，已引进用于治疗各种病况，例如炎性疾病、癌症和感染巧）。许多初始治疗性单 克隆抗体通过采用亲和层析、离子交换层析和可能的凝胶过滤的连续纯化步骤从细胞培养 物中纯化化）。相当常见的亲和纯化步骤基于IgG与来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A(proteinA)之间的相互作用。固定至适当树脂的蛋白A用作含单克隆抗 体的细胞培养物的捕获剂。该步骤在富集期望分子方面非常有效，同时来自细胞培养物的 污染物显著减少。
[0008]不幸的是，在该过程中用于纯化的配体可从树脂中浸出（leach)，并W成为纯化物 质的杂质告终。浸出可由于所用解离条件而发生，例如配体通过来自细胞培养物的组分的 蛋白质水解裂解，而且所用树脂的性质、固定化学和与亲和树脂制造相关的其它方面，W及 反应物之间的生物特异性相互作用中涉及的力，都可能导致配体在某种程度上的浸出。无 论涉及何种特定机理，配体可污染亲和树脂上的待纯化产物。依赖于杂质配体的特定的生 物学性质，施用根据该些原理纯化的、可能含有具生物学活性杂质的治疗性蛋白质，可诱导 非期望的副作用，例如过敏性休克或补体激活，增加治疗的风险概况（risk-profile)。
[0009] 由葡萄球菌（staphylococci)产生的天然蛋白质A主要w两种不同的方式与免疫 球蛋白相互反应：
[0010] ?典型相互作化涉及人IgG的化部分（7)。
[0011] ?替代相互作用，涉及免疫球蛋白，不考虑免疫球蛋白类别巧），属于重
[0012] 链可变区的VhH1(9)基团。
[0013] 天然蛋白A具有五个免疫球蛋白结合结构域（10)，每个结构域可分别独立地与 IgG部分化Y和F油相互作用。该产生IgG和蛋白A之间的多重相互作用的可能性，甚至 W等摩尔比例形成沉淀（7)。然而，还可能在反应物所占比例非常不同的条件下，涉及多种 复合体形成中潜在的相互作用，而形成异质性复合体。
[0014] 天然蛋白A已使用重组技术修饰（11)。一个实例是，当天然葡萄球菌蛋白A或该 分子的重组形式，即多聚体形式的片段Z(ll)，或M油SelectSuRe?配体（GEHealthcare LifeSciences,Uppsala,Sweden)，即为改进在重复的就地清洗（cleaning-in-place)步骤 中的稳定性而对碱耐受性进行了修饰（12)(在层析介质M油SelectSuRe?中固定于琼脂糖 上）的蛋白A衍生分子蛋白A，在纯化过程中用作配体。因此，在纯化步骤期间，一旦在连续 的纯化过程中缓冲条件达到允许蛋白A与IgG之间的复合体形成的抑，天然蛋白A或其重 组亲缘体（recombinantrelatives)可分别从树脂中浸出并与洗脱的IgG形成复合体。在 中性抑下对蛋白A相对于Wppm表达的IgG的量进行定量，该一尝试可能受到蛋白A上相 关表位有限的可接近性的影响。该可能导致低估蛋白A的真实浓度。为了避免患者暴露于 浸出的蛋白A的过高浓度下，该些水平应小于12-14ppm(13)。
[0015] 两种不同的原理已应用于破坏蛋白A-I泌复合体，W便使蛋白A可被接近而定量：
[0016] ?在辅助变性过程的化合物的存在下，存在于用于定量蛋白A的样品中的IgG组分 的热变性（14)。蛋白A被认为抵抗来自此类处理的变性。一旦复合体中的IgG组分变性， 该过程将释放蛋白A部分用于精确定量（15)。
[0017] ?样品的酸处理，W解离预形成的复合体并在酸性条件下进行免疫测定（16 ;W0 91/10911)。该里，用于免疫测定的免疫试剂必须耐受所选的酸性条件。一方面，最佳地，所 选抑应定量解离蛋白A和IgG之间的复合体（即，从化和/或Fab区解离蛋白A)，同时， 另一方面，该测定仍是功能性的，已证实结合是难W满足的。
[0018] 在许多情况下，热变性并不可行。一个实例是当使用WGyrokb?系统佑yros AB，化psala，Sweden)为代表型号的一种分析系统，其中测定在设置于可旋转的压缩盘 (compactdisk,CD)中的微流体结构中进行。首先，样品的热处理将必须在CD和仪器外进 行，因为其中没有可用的加热机构。其次，可能在CD内部的热处理将破坏CD中包含的重要 功能，还潜在地产生与基于微流体的测定原理不相容的蛋白聚集体。当加热在CD外进行 时，可能的是，可能形成蛋白颗粒，伴随堵塞微结构的风险，除非采取适当的预防措施。
[0019] W0 2008/033073A1公开了一种测定流体样品中分析物总浓度的方法，其中至少 部分分析物作为与分析物-结合物质的复合体存在。该方法包括下列步骤：a)使样品处 于可减少分析物与分析物-结合物质之间结合亲和力，足W实质上使任何分析物复合体 解离，并将实质上所有的分析物W游离形式提供的条件，b)使样品处于恢复分析物与分析 物-结合物质之间结合亲和力的条件，和C)在结合亲和力已恢复后即刻，并且在发生分析 物的任何实质上的再复合之前，测定样品中游离分析物的浓度。在一个实施方案中，该方法 在使用无标记的检测，例如表面等离子体共振（surfaceplasmonresonance,SPR)等的流 动系统中进行。
[0020] W0 2009/022001A1公开了一种基于表面等离子体共振的方法用于检测针对治疗 性药物的抗药物抗体（ADAs)。在待分析的患者样品中在药物存在下的药物干扰通过酸化样 品（pH2. 5或3)来克服，然后在分析前中和样品。
[0021] 本发明的目的为提供用于定量样品中总分析物，包括复合形式的分析物的方法， 该方法基于通过酸处理的复合体解离，且对于各种分析物和捕获剂，特别是抗体，通常是起 作用的。
【发明内容】