肾癌血液生物标志物(Biomarker)的检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种肾癌血液生物标志物的检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肾脏在身体中扮演着过滤装置的角色，能够从血液中去除废物、多余水分及盐分。 肾癌通常表示发生在肾脏的实质部（肾脏中制造尿的细胞集聚而成的部分，其由髓质与皮 质构成）的肾细胞癌（renalcellcarcinoma)。典型地，肾细胞癌通常W发生在一侧肾脏 的单一肿瘤为典型例，但有时候也会侵犯到两侧肾脏。
[0003] 肾细胞癌可W分类为透明细胞型肾细胞癌（clearcellRCC)、乳头状肾细胞 癌（papillaryRCC)、嫌色性肾细胞癌（C虹omo地obeRCC)、髓质性肾细胞癌（medullary RCC)、未分类肾细胞癌（unclassifiedRCC)、肾孟移行细胞癌化i化eytransitionalcell carcinoma,TCC)、肾嗜酸细胞癌（ranaloncocytoma)等，其中，透明细胞型肾细胞癌占 66~75%，乳头状肾细胞癌占15 %左右，嫌色性肾细胞癌占5 %左右。
[0004] 肾细胞癌可W根据Roboson分期体系如下分类，局限于实质部内的肿瘤称为第一 期，浸润到肾皮膜外或者局限于肾筋膜内的肿瘤称为第二期，转移到肾脏周围血管或淋己 结时称为第=期，侵犯到肾脏周围的其它脏器或者发生远距转移时称为第四期。第一期还 根据肿瘤大小而如下区分，肿瘤大小低于4cm时称为la，4cmW上时称为Ib，第S期则对侵 犯到肾静脉或下腔静脉等肾脏周围血管者称为III/a期，如果转移到肾脏周围淋己结则称 为III/a期。
[0005] 肾癌主要发生在60~70岁的老年层并且呈现出持续增加的趋势，在韩国的男性 癌症病人中W2.0%占据第10位，在韩国女性癌症病人中W1.2%占据第15位。肾癌在肿 瘤大小较小时几乎没有任何症状，肿瘤生长到一定大小而成为推挤脏器的程度时才会出现 症状。最常见的症状是血尿，但也仅呈现在60%左右的患者。因此，常常出现诊断过迟的情 形而在第一次诊断出来时大约有30%的患者已经处于转移状态，并且根据转移的部分而出 现呼吸困难、咳嗽、头痛之类的症状。
[0006] 大多数情况下，诊断肾癌时利用x-ray、CT摄影、超声波及组织分析之类的方法。 该些方法难W区分各种形式的肾癌，需时较长，劳动力的投入较多。
[0007] 本发明的技术方案则把能够适用于肾癌早期诊断及非侵入性诊断的3种肾 癌血液生物标志物NNMT(NicotinamideN-meth}dtransferase)、LCP1 (L-Plastin)及 NM23A(Non-metastaticcellsIprotein)加W组合?利用而得W提高肾癌诊断能力。
[000引解决的技术课题
[0009] 本发明的目的是提供一种肾癌血液生物标志物的检测方法。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种肾癌血液生物标志物的检测试剂盒化it)。
[0011] 本发明的其它目的或具体目的将在后述说明中得到阐述。
[0012] 解决课题的技术方案
[0013] 本发明提供一种肾癌血液生物标志物的检测方法。
[0014] 本发明人利用取自肾癌患者100人与正常人90人的共190个血液试剂进行了预 备实验并且得知患者群的NNMT、LCP1及醒23A的血中浓度高于正常人群，从而得W确认该 些蛋白质具有作为肾癌血液生物标志物的可能性，把上述3种肾癌血液生物标志物组合后 通过ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲线分析法对肾癌诊断能力进行评估时， 发现该些标志物的诊断能力得到了提升。具体地说，3种血液生物标志物中诊断能力最强 的NNMT(在NNMT、LCP1及NM23A等3种标志物中NNMT的诊断能力最高，请参考下列实施 例）的准确度（AUC)为0. 927,特异度为95 %时灵敏度为69 %，但是把3种血液生物标志物 组合后适用逐步逻辑回归分析法（stepwiselogisticregressionanalysis)时，准确度 为0.9333,特异度为95 %时灵敏度为77%，适用下列实施例中的计分法（scoringmethod) 时，AUC为0. 948,特异度为95 %时灵敏度为89%。
[0015] 更进一步，W使用该190个血液试剂的预备实验的结果为基础，本发明人根据基 于上述计分法的上述3种肾癌血液生物标志物的组合对30个正常人血液试剂与29个患 者血液试剂实际进行盲试化lindtest)实验并且在其结果发现能够把正常人30人中的 29人识别成正常人而能够把患者29人中的28人识别成患者（亦即，灵敏度96. 67% = 29/30X100(% )、特异度 96. 55%= 28/29X100(% ))。
[0016] 本发明的肾癌血液生物标志物的检测方法是W该实验结果为基础提供的，具体地 说，其包括下列步骤；步骤（a)，让取自受检人的血液试剂或其加工试剂与特异于各个肾癌 血液生物标志物NNMT、LCP1及醒23A的结合分子反应，让存在于上述试剂的肾癌血液生物 标志物NNMT、LCP1及醒23A各自和特异于它的结合分子形成结合体；及步骤化），检测上述 结合体。
[0017] 在上述内容中，NNMT(nicotinamide-N-meth}dtransferase)是一种参与到烟酷胺 (nicotinamide)的甲基化转移（N-methylation)的酶并且由总共264个氨基酸组成，其分 子量为29. 6邸a。其基因序列被揭不为GeneBankAccessionnumber:NM_006169,其氨基酸 序列被揭示为GeneBankAccessionnumber:NP_006160. 1。
[001引在上述内容中，LCP-l(L-Plastin)是肌动蛋白结合蛋白系列的一种，其具有L型 与T型等两种形态，其中的L型被认为只在hemopoieticcell表达，总共由627个氨基酸组 成，分子量为70. 8邸a。其基因序列被揭不为GeneBankAccessionnumber:NM_002298. 4， 其氨基酸序列被揭示为GeneBankAccessionnumber:NP_002289. 1。
[0019] 而且，在上述内容中，醒23A是被认为在肿瘤转移较为活泼时mRNA量减少的基因 的蛋白质醒23的A型异构体。总共由152个氨基酸组成，分子量为16. 9KDa。其基因序 列被揭不为GeneBankAccessionnumber:NM_198175. 1，其氨基酸序列被揭不为GeneBank Accessionnumber:NP_000260.l〇
[0020] 能够凭借本发明的检测方法把血液中的肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及NM23A 全部予W定量，该些定量值则由医师之类的医疗专家用来判断肾癌罹患与否、肾癌发展程 度及/或肾癌治疗经过。
[002U 尤其是，本发明的检测方法能够把肾癌血液生物标志物NNMT、LCP1及醒23A全部 检测，因此即使如下列实施例所述地应用于肾癌初期阶段的第一期患者也能呈现出96%的 特异度（把正常人120人中的115人识别成正常人，96%= 115/120X100)及95%的灵敏 度（把第一期的患者59人中的56人识别成患者），从而能够非常有效地适用于肾癌的早期 诊断（作为参考，作为单一生物标志物而具有最强诊断能力的NNMT也只呈现出86%的特 异度与92%的灵敏度），而且对肾细胞癌类型中占大多数的透明细胞型肾细胞癌也呈现出 96%的灵敏度而能够非常有效地适用于透明细胞型肾细胞癌的诊断（作为参考，作为单一 生物标志物而具有最强诊断能力的NNMT也只呈现出93%的灵敏度）。
[0022] 在本说明书中，"血液的加工试剂"指的是血浆或血清。
[0023