一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测amh和inhb的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种双标记快速时间分辨荧光免疫法试剂盒，尤其涉及一种适于利用 双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织（WHO)，生育问题困扰着约10 %的夫妻，影响全球多达8000万 人，而且这一数字还在不断上升。正常女性生殖系统的受孕能力称为生育潜能。卵巢储备 功能（ovarian reserve，OR)体现的是女性的生育能力，OR降低是指卵巢中的存留卵子量 降到阈值以致影响了生育潜能，导致生育力低下。由于OR与生育和不孕症诊治关系密切， 而日益受人关注。对尚未完成生育大事，未来即将准备受孕之女性，OR评估非常重要，因为 OR多寡提供了选择治疗方向之参考，愈来愈多年轻女性正面临卵巢早衰之威胁，所以用科 学方式评估OR的重要性越来越高。
[0003] 近年来，随着不孕症发病率的逐年升高，辅助生殖技术（Assisted Reproductive Techno Iogy，ART)实现了很多不孕患者的生育愿望，更为广泛的应用到不孕症的治疗中。 在 ART 中，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)最 具有代表性。如何获得足够数量的优质卵子是决定IVF-ET成功率的重要因素。在IVF-ET 治疗过程中，控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，C0H)并获得多个 成熟的卵子是治疗成功的关键，而COH的效果又取决于卵巢的反应性。卵巢的反应性主 要由卵母细胞的数量和质量，即OR来决定。在COH的过程中，OR和卵巢对外源性促性腺 激素（gonadotropin，Gn)的反应性是影响COH的重要因素。OR是指卵巢皮质内的被己 经募集的卵泡，逐步发育为可受精卵母细胞的潜能，它受卵泡数量和质量的影响，当卵泡 的数量或质量下降时，卵巢对Gn刺激的反应性降低，导致获卵数的减少甚至无卵可取，从 而使妊娠率降低，影响妊娠结局。相对于卵巢的低反应，当卵巢对Gn过于敏感时，引起卵 巢过度反应，在促排卵过程会有过多的卵泡同时发育成熟，使机体内的雌激素水平过高， 卵巢过度增大，容易引发促排卵过程中较为常见的并发症，卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome, 0HSS)。过度反应会刺激更多的卵泡生长，可能会取得更多的 卵子供体外受精使用，但这并不意味着会相应的得到高质量的胚胎及理想的妊娠结局。约 有15%~20%的促排卵周期因为轻度到中度的OHSS而被取消，而严重的OHSS会因血管通 透性的增加，使患者出现胸水、腹水、无尿等症状，发生休克，甚至危及生命。因此，在促排卵 之前，需要对患者的OR和反应性进行评估和预测，选择合适的促排卵方案，个体化用药，预 防并发症的出现，减少患者的身心及经济负担，提高抱婴率。如何在COH治疗中正确评价卵 巢的储备能力及其对COH的反应性，寻找评估OR的理想指标，预防卵巢低反应和卵巢过度 刺激的发生，一直是生殖领域的研宄热点之一。
[0004] 目前，临床上用来评估卵巢储备功能的指标包括年龄，基础卵泡刺激素 (follicle-stimulating hormone，FSH)、促黄体生成素 （luteotropic hormone，LH)、雌 二醇（Estradiol，E2)、窦卵泡计数（antral follicle count，AFC)、血清抗苗勒管激素 (Anti-MUllerian Hormone，AMH)、抑制素 B(Inhibin B，INHB)等。AMH 和 INHB 都是由卵泡 周围的颗粒细胞产生。血清AMH水平与AFC、基础E2有较强的相关性。随着年龄的增加， 卵巢储备功能降低，血清AMH水平出现降低，并且AMH被认为是能最早揭示这一生理现象的 指标。而血清AMH在整个月经周期保持相对的稳定性，可在月经周期的任何一天进行检测， 传统预测卵巢功能与库存量之方式采经期1至3天抽血检测FSH，但FSH经常会有误差，如 卵巢手术过可能FSH正常但事实上已濒临衰竭，又如子宫内膜异位症妇女，卵巢功能实际 上已经衰退，但FSH却还在正常范围。因此，AMH的测定不受月经周期的限制，与FSH和E2 相比，AMH是评估OR的优异指标。大量文献表明，血清AMH与获卵数的相关性比年龄、基础 FSH、LH更强，能够更好的预测卵巢的储备和反应性。同时，对于INHB的研宄指出，当OR降 低时，INHB水平下降，但是比基础FSH水平的升高，E2的下降出现的更早。血清INHB是由 颗粒细胞产生，推测能比基础FSH更直接，更敏感的体现卵巢储备功能及反应性。血清AMH、 INHB因其特有的优势，近年被更多人的用来评估OR和研宄其是否与妊娠结局有关。血清 AMH、INHB血液检测试剂盒可产生标准化的结果，而使用超声波评估OR时，评估结果通常依 赖于操作者或诊所。
[0005] 目前没有任何一项研宄使用单一的标志物预测OR可以获得满意的灵敏度和特异 度，提高预测标志物的检测阈值虽然可以增加特异度，但是灵敏度会随之下降，反之亦然， 所以将标志物联合检测可以提高对OR的预测。有研宄表明血清AMH和INHB水平呈正相关， 在临床工作中联合应用检测AMH和INHB水平，可以提高对OR的预测。OR减退是一个渐进 性的过程，早期发现及诊断OR减退，及时进行干预，可以改善女性的生殖潜能，提高受孕能 力及妊娠结局。血清基础AMH和INHB水平与OR密切相关，二者是目前有价值的预测指标。
[0006] 目前用于检测AMH和INHB常分别采用单一试剂盒，即一个试剂盒仅能检测AMH 或INHB，此种方式存在以下缺点：1.检测步骤繁多，特别是手工法容易导致实验出现错误； 2.加样时间长，检测时间长，费时费力；3.样本需要量大，导致采血量增加；4)目前AMH和 INHB采用的酶联免疫法检测时间较长（1~3h)。
[0007] 目前常用免疫方法有放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA)、酶 联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)、化学发光 免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA)、电化学发光免疫分析法 (electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI)等。RIA 由于放射性污染，对环境和 操作者影响较大，批内批间变异较大，难于自动化；ELISA采用大分子酶标记，且酶容易 失活，这种依靠比色法或偏振光法的检测技术所受的干扰因素太多（即使是优秀的"管 式ELISA"，其试管形状的变化也会影响试验的结果），其灵敏度、线性和稳定性未能高于 RIA ;CLIA的化学发光通常是瞬间完成，发光峰值很快衰减，温度和pH值对发光有很大影 响，该类因素影响了该类方法的应用；ECLI仍为非开放系统，试剂依赖进口，试剂昂贵， 维修及检测成本高，这也限制了其推广应用。由于时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)独特的技术原理，有区别于传统的免疫标记技术的特点和优 势，已被人们广泛接受，与现在广泛使用的RIA、ELISA、CLIA和ECLI相比，TRFIA克服了 RIA 放射性污染的不足、酶标记物的不稳定性和定量范围窄的缺陷、化学发光仅能一次发光、一 般荧光标记受环境干扰的难点和ECLI的非直接标记等缺点，铕（Eu)标记TRFIA的灵敏度 可达l(T19m〇l/L，应用范围广，致使其试剂盒的生产和检测仪器的更新换代进展甚速，目前 已实现了分析技术的自动化，TRFIA已成为生物医学研宄和临床超微量生化检验中一项最 有发展前景的分析手段。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于解决现有技术中一个试剂盒仅能单独检测AMH或INHB、灵敏度 较低、检测步骤繁琐、加样时间较长以及血样本用量较多的问题。
[0009] 因此，本发明提供了一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和 INHB的试剂盒，包括：1)包被有AMH包被抗体和INHB包被抗体的固相载体；2)AMH和INHB 的混合校准品；3)镧系元素1标记的AMH检测抗体；4)镧系元素2标记的INHB检测抗体； 5)免疫反应促进液；6)浓缩洗液以及7)增强液。
[0010] 在上述技术方案中，由于血清基础AMH和INHB水平与OR密切相关，二者是目前有 价值的预测指标，两者联合检测可以提高对OR的预测。AMH和INHB双标记快速时间分辨荧 光免疫分析方法及试剂盒的研制，与传统方案及单标记方法检测AMH和INHB相比，可更快 的获得更可靠的检测结果。
[0011] 在上述技术方案中，AMH包被抗体和AMH检测抗体可结合AMH分子上不同的抗原 结合位点，AMH包被抗体包被在固相载体上，而AMH检测抗体被用于与镧系元素1结合，以 制得镧系元素1标记的AMH检测抗体标记物。同理，INHB包被抗体和INHB检测抗体可结 合INHB分子上不同的抗原结合位点，INHB包被抗体包被在固相载体上，而INHB检测抗体 被用于与镧系元素2结合，以制得镧系元素2标记的INHB检测抗体标记物。因此，向试剂 盒中的固相载体加入待测样品、镧系元素1标记的AMH检测抗体标记物和镧系元素2标记 的INHB检测抗体标记物以后，待测样品中的AMH通过其两个结合位点分别与AMH包被抗体 和镧系元素