一种降钙素原光激化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及试剂盒诊断检测领域，具体设及一种降巧素原光激化学发光免疫分析 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 细菌或病毒等经由创面、呼吸道、泌尿道、消化道入侵，在严重创伤，全身抵抗力 下降，体内正常菌群失调，细菌移位等时，均可引起机体出现严重的感染症状，是引起临床 各种并发症，如脈毒症、败血症休克，多器官功能障碍症（multiple organ dys化nction syn化ome，M孤巧，乃至死亡的主要原因。据美国2001年统计资料显示，该年仅重度脈 血症就有75. 1万例，平均死亡率高达28. 5%，该意味着该年死亡的人数竟然是爱滋病 (acquired immunodeficien巧syn化ome, AID巧的近S倍。对感染性疾病及其并发症能早 期诊断和及时治疗，可有效降低死亡率。而目前常规使用的诊断指标（如白细胞分类和计 数，C-反应蛋白，血常规检查等），由于是非特异性的，所W易引起误诊或漏诊。
[0003] 1990年发现的降巧素原（procalcitonin，PCT)经证实其在血清中浓度的增高与 感染的发生有密切关系，能为疾病的诊断、鉴别，治疗方案的选择，预后判断等提供新的实 验室标准。在正常及健康的个体中，其血清浓度极低，仅为10-5化g/ml，一般方法检测不 到。在全身性细菌、真菌及寄生虫感染，系统炎症反应综合症、败血症、急慢性肺炎、急性膜 腺炎、活动性肝炎、创伤等患者的血清PCT水平异常增高，其浓度科大正常水平的几倍甚至 上万倍；在病毒感染，自身免疫性疾病，器官移植排除反应等患者的血清浓度不增高或轻微 增高。该就决定了PCT的高度特异性，因此可用于此类疾病的鉴别诊断，在全身性细菌感染 和脈毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值，可广泛用于ICU病 房、血液科、外科、内科、器官移植科、治疗实验室等。
[0004] 目前PCT在医院和血液系统广泛使用的检测方法看，大部分是标记免疫分析技 术，此技术具有灵敏度高、特异性强等优点，已被广泛应用于PCT的基础研究和临床各个领 域的应用研究。最常用的标记免疫分析技术是放射免疫分析化IA)和酶免疫分析巧IA)，但 在实际应用中存在着一些缺陷；RIA的放射性核素污染、标记物的货架期短；EIA酶的活性 容易失活，导致其灵敏度不高，酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构，使得EIA灵 敏度的提高受到限制。
[0005] 光激化学发光法（AlphaLisa)是通过引用激光技术和纳米微球技术为基础的新 型化学发光免疫技术，该技术将被广泛应用于研究生物分子的幸相互作用。AlphaLisa试剂 由含有生物素化抗体、包被有抗体的受体微球和链霉亲和素化供体微球共同组成。微球表 面覆盖多糖水凝胶，故能减少非特异性结合，并增加微球的悬浮性；纳米级微球大大增加了 反应的表面积；同时反应在均相进行，故它具有快速、免洗板、灵敏度高、量程宽、操作简便 实现自动化操作等优点。
[0006] AlphaLisa技术的核屯、原理是单线态氧的产生和传递。在680nm的光照下，供体 微球中的光敏物质受到激发产生单线态氧，单线态氧扩散至受体微球，与其中的发光物质 反应后产生615nm的化学发光。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短（约4 y s)， 只能扩散约200nm的距离，因此只有那些通过包被在微球表面的生物分子拉近受体微球和 供体微球才能产生化学发光。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种检测降巧素原的试剂盒。
[000引本发明另一目的在于提供上述检测降巧素原的试剂盒的制备方法。
[0009] 本发明还有一个目的在于提供上述检测降巧素原的试剂盒的检测方法。
[0010] 本发明上述目的通过W下技术方案予W实现：
[0011] 本发明主要采用光激化学发光免疫分析法（AlphaLisa)检测PCT。其技术方案为： 一种降巧素原PCT的光激化学发光免疫分析试剂盒，由（1)白色不透明96孔板，（2)PCT定 标品，（3)包被有抗-降巧素原单克隆抗体的受体微球，（4)生物素化抗-降巧素原单克隆 抗体，（5)链霉亲和素化的供体微球。
[0012] 其中，所述降巧素原定标品是降巧素原溶于含有牛血清白蛋白的Tris-HCl缓 冲液中，共六管，浓度依次为 0ng/mL、0. 5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL，每管 0. 5血冻干；
[0013] 所述包被有抗-降巧素原单克隆抗体的受体微球2. 5mU含抗体浓度为1. 0~ 15. 0 y g/mL ；
[0014] 所述生物素化抗-降巧素原单克隆抗体2. 5血，含抗体浓度为1. 0~15. 0 y g/血；
[0015] 所述链霉亲和素化的供体微球20血，含微球量30. 0~100. 0 y g/血。
[0016] 包被有抗-降巧素原单克隆抗体的受体微球的制备：将0. 2mg PCT单克隆抗体加 入到带有滤膜的离屯、管中，W 8 00化/min离屯、5~6min，用标记缓冲液化13mol/L，pH 8. OPB巧重复洗漆6次后，在抗体溶液中加入Img受体微球、10化25mg/mL NaB册CN(用标 记缓冲液配制）、1. 25 y L 10% Tween-20,用标记缓冲液将体积补充到200 y L 37°C避光振 荡反应48小时。加入lOyL 65mg/mLCM0(用0.8M化OH配制）封闭未结合位点，37°C避光 解育1小时后离屯、洗漆，得到已连接抗体的受体微球，稀释备用。
[0017] PCT 定标品，用标准品缓冲液巧Ommol/L Tris-HCl，1. 5% BSA、0. 9% 化C1、0. 05% Proclin-300、0. 01% Tween-20，pH7. 8)将 PCT 配制成 0ng/mL、0. 5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、 25ng/mL、5化g/mL系列浓度，每瓶0. 5血分装冻干，4°C保存备用。
[0018] 生物素化抗-降巧素原单克隆抗体，将Im评CT单克隆抗体加入到带有滤膜的离 屯、管中，W 8000r/min 离屯、5 ~6min。用标记缓冲液（0.1mol/L、化2C03/Na肥03, pH 9. 5) 重复洗漆6次后，将50 y L抗体溶液中加入5 y L22mg/mL生物素中（用DMS0配制），室温振 动解育化。利用PBS (抑7. 4) 4°C透析24小时，每化换液一次，收集透析袋中液体，稀释备 用。
[0019]用所述的试剂盒检测PCT的方法，测定的基础是标记免疫反应。顺次向白色不透 明微孔板中加入定标品或待检测样品，包被有抗-降巧素原单克隆抗体的受体微球，生物 素化抗-降巧素原单克隆抗体进行免疫反应；接着加入链霉亲和素化的供体微球进行反应 后检测信号值，W加入PCT定标品的检测值绘制标准曲线，W加入待检测样品的检测值从 标准曲线计算被测样品的PCT含量。
[0020] 所述的检测PCT的方法，其操作为；将定标品、包被有抗-降巧素原单克隆抗体 的受体微球、生物素化抗-降巧素原单克隆抗各25 y L加入到白色不透明板孔中，37°C振 动解育15min，然后再加入链霉亲和素化的供体微球175y^37°C振动解育15min后在 A1地aScreen/Lisa检测仪上检测信号值，从标准曲线计算出被测样品的PCT含量。
[0021] 上述待测样品包括血清。
[0022] 本发明所用到的受体微球和链霉亲和素化的供体微球均购自Perki址Imer。
[0023]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0024] 本发明是采用光激化学发光检测技术，测定人血清样品中的降巧素原的定量体外 诊断试剂盒，可W与其他血清和临床信息联合用于诊断和鉴别诊断个体感染性疾病。本发 明的试剂盒采用光激化学发光法测定标本中的PCT含量，具有快速、灵敏度高、量程宽、操 作简便等优点，在方法学上较酶免法能达到更高的灵敏度和更宽的检测范围。
【附图说明】
[0025] 图1;降巧素原光激化学发光免疫分析试剂盒技术原理图。<