确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药领域，特别涉及确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分 的方法。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病已经成为当今社会中致死率最高的疾病之一，并且发病率逐年增加。 心血管疾病的种类很多，其中，发病率较高的一类是缺血性心脏病。这种缺血性心脏病包括 粥样硬化病变引致的冠状动脉梗阻或狭窄。心肌缺血引致的左心室室壁瘤，心肌栓塞后心 室间隔缺损和乳头肌缺血引起的二尖瓣关闭不全，是中老年常见多发的后天性心脏病。
[0003] 研宄表明，这种缺血性心脏病主要是由于长时间缺血导致心肌细胞缺氧引起心肌 组织损伤和坏死，受损的心肌细胞炎性因子过度表达，其中白介素 1 β (1L-1 β )可刺激细 胞产生应激性氧分子，使心肌细胞膜通透性增加，产生脂质过氧化物使得三磷酸腺苷合成 受阻，从而直接损害心脏的电生理功能和泵血功能，最终使心肌细胞变性，坏死。
[0004] 中药对上述缺血性心脏病一般有较好的疗效，例如通脉养心丸等。这些治疗缺血 性心脏病的中药都具有心肌保护和抗炎作用。但是，由于中药化学成分复杂，现在还不清楚 各中药中具体哪些化学成分是具有心肌保护和抗炎作用的活性成分，无法测定这些活性成 分的含量，这样不利于对中药进行质量控制，也影响中药的临床疗效。因此，如何能建立中 药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的确定方法，就显得格外重要。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明实施例公开了确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活 性成分的方法。
[0006] 确定中药中具有心肌保护和抗炎作用的活性成分的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)通过制备液相色谱获得目标中药各分离组分；
[0008] (2)通过心肌细胞抗氧化模型实验确定具有心肌保护作用的活性成分，所述心肌 细胞抗氧化模型实验包括：
[0009] (A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著 细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
[0010] (B)将目标心肌细胞分别用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分进 行保护，然后用指定氧化剂分别对已进行保护的目标心肌细胞进行损伤，并确定损伤后的 目标心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞 的相对保护率；
[0011] (C)将对目标心肌细胞相对保护率达到最低有效率的目标中药分离组分经LC-MS 分析，确定出相对保护率达到最低有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
[0012] 用所确定的化学成分分别代替（B)部分的目标中药各分离组分，重复执行的（B) 部分的操作，确定各化学成分的相对保护率，并将相对保护率达到最低有效率的化学成分 确定为具有心肌保护作用的活性成分；
[0013] (3)通过巨噬细胞抗炎模型实验确定具有抗炎作用的活性成分，其中所述巨噬细 胞抗炎模型实验包括：
[0014] (a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价，确定无显著 细胞毒的目标中药各分离组分的浓度；
[0015] (b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显著细胞毒的 浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上清液中的NO 的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO相对抑制 率；
[0016] (c)将对目标巨噬细胞的NO相对抑制率达到抗炎有效率的目标中药分离组分经 LC-MS分析，确定出NO相对抑制率达到抗炎有效率的各分离组分中所包含的化学成分；
[0017] 用所确定的化学成分分别代替（b)部分的目标中药各分离组分，重复执行（b)部 分的操作，将NO相对抑制率的半数抑制浓度在指定值以下的化学成分确定为具抗炎作用 的活性成分。
[0018] 其中，步骤（1)包括：获得目标中药的中药提取液，然后使所述中药提取液通过反 相色谱柱；再对反相色谱柱进行洗脱，将洗脱液通过制备液相色谱进行分离，收集目标中药 各分尚组分。
[0019] 其中，所述获得目标中药的中药提取液，包括：
[0020] 将目标中药与甲醇水溶液混合后，进行提取、过滤，得到中药提取液；
[0021] 所述反相色谱柱具体为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的中压反相色谱柱。
[0022] 其中，所述（A)将目标中药各分离组分针对目标心肌细胞分别进行细胞毒评价， 确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：
[0023] 将H9c2心肌细胞在不加任何药物、分别加入第一指定浓度的目标中药各分离组 分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物及分别加入第一指 定浓度的目标中药各分离组分的H9c2心肌细胞的数量；并以不加任何药物的H9c2心肌细 胞的数量为标准，分别计算加入第一指定浓度的目标中药各分离组分后H9c2心肌细胞存 活率；如果存活率在85%以上，则确定所述第一指定浓度为无显著细胞毒的该目标中药分 离组分的浓度。
[0024] 其中，所述（B)将目标心肌细胞用已确定无显著细胞毒的浓度的目标中药各分离 组分分别对目标心肌细胞进行保护，然后用指定氧化剂其进行损伤，并确定损伤后的目标 心肌细胞的剩余数量，并根据所述剩余数量确定目标中药各分离组分对目标心肌细胞的相 对保护率，具体为：
[0025] 将H9c2心肌细胞分成对照1组、实验1组及模型1组在相同的条件下进行培养； 其中，实验1组加入在（A)部分已确定浓度的目标中药各分离组分进行预保护；对照1组及 模型1组不加任何药物；培养结束后，将实验1组及模型1组分别加入指定氧化剂进行H9c2 心肌细胞损伤；损伤后，通过酶标仪在第一预设波长下分别测定对照1组吸光度值DO 5iffiP 实验1组吸光度值DOisu及模型1组吸光度值DO i ;通过计算分别得到实验1组的相对 保护率S^1，
[0026] 其中，实验1组的相对保护率的计算公式为：
[0027] S实验丄％ = (DO实验丄_DO模型丄）/ (DO对照丄_DO模型丄）X 100 %。
[0028] 其中，所述（a)将目标中药各分离组分针对目标巨噬细胞分别进行细胞毒评价， 确定无显著细胞毒的目标中药各分离组分的浓度，具体为：
[0029] 将小鼠巨噬细胞RAW264. 7在不加任何药物、分别加入第二指定浓度目标中药各 分离组分的情况下，在相同的条件下进行培养；培养结束后，确定不加任何药物、及分别加 入第二指定浓度目标中药各分离组分的小鼠巨噬细胞RAW264. 7的数量；并以不加任何药 物的小鼠巨噬细胞RAW264. 7的数量为标准，分别计算加入第二指定浓度目标中药各分离 组分后的小鼠巨噬细胞RAW264. 7存活率；如果存活率在85 %以上，则确定所述第二指定浓 度为为无显著细胞毒的该目标中药分离组分的浓度。
[0030] 其中，所述（b)将目标巨噬细胞分组培养，每组的培养液中加入一种已确定无显 著细胞毒的浓度的目标中药各分离组分及指定炎症诱导剂，培养结束后，确定各培养液上 清液中的NO的含量，并根据所述NO的含量确定目标中药各分离组分对目标巨噬细胞的NO 相对抑制率，具体为：
[0031] 将相同数量的小鼠巨噬细胞RAW264. 7分成对照2组、实验2组及模型2组在相同 的条件下进行培养；其中，实验2组加入在（a)部分已确定浓度的目标中药各分离组分及脂 多糖；对照2组不加入任何物质，模型2组只加入脂多糖；培养结束后，取对照2组、实验2 组及模型2组培养液中的上层清液；采用Griess法，通过酶标仪在第二预设波长下分别测 定对照2组吸光度值DO 5iffi2、实验2组吸光度值DOs^2及模型2组吸光度值DO eS2;通过 计算分别得到实验2组的相对NO抑制率，
[0032] 其中，实验2组的相对NO抑制率的计算公式为：
[0033] D实验 2 % = (D0模型 2_D0实验 2) / (D0模型 2_D0对照 2) X 100 % 〇
[0034] 其中，所述目标中药为通脉养心丸。
[0035] 本发明通过将目标中药中的化学组分进行初步分离得到目标中药各分离组分，然 后再分别进行确定具有心肌保护作用的活性成分的实验及确定具有抗炎作用的活性成分 的实验，从而确定目标中药中所含有的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分。根 据所确定出的具有心肌保护作用和抗炎作用的中药活性成分，可以容易的确定中药活性成 分的含量，进而可以实现对目标中药的质量控制，保证对目标中药的临床疗效。
【附图说明】
[0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0037] 图1为通脉养心丸18种分离组分对H9c2心肌细胞的细胞毒评价结果；
[0038] 图2为通脉养心丸18种分离组分的相对保护率；
[0039] 图3为通脉养心丸中TM13、TM14、TM15、TM16、TM17对H9c2心肌细胞保护活性量效 关系图；其中，图3a为TM13的保护活性量效关系图，图3b为TM14的保护活性量效关系图， 图3c为TM15的保护活性量效关系图，图3d为TM16的保护活性量效关系图，图3e为TM17 的保护活性量效关系图；
[0040] 图4为通脉养心丸中TM13、TM14、TM15、TM16、TM17的LC-MS分析谱图，其中，图4a 为TM13的LC-MS图，图4b为TM14的LC-MS图，图4c为TM15的LC-MS图，图4d为TM16的 LC-MS 图，图 4e 为 TM17 的 LC-MS 图；
[0041 ] 图5为通脉养心丸18种分离组分对小鼠巨噬细胞RAW264.