使用侧向流免疫层析技术来检测肠道病毒的现场测定的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年9月12日提交的题为"Point-Of-Care Assay For The Detection Of Enteroviruses Using Lateral Flow Immunochromatographic Technology"的新加坡专利申请No. 201206800-3的优先权并且为该专利申请的转换，其通 过引用以其整体并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容涉及用于检测病毒的现场侧向流免疫层析测定（point-of-care lateral flow immunographic assay)。特别地，本公开内容涉及用于检测肠道病毒的现场 侧向流免疫层析测定。
【背景技术】
[0004] 手足口病（Hand，Foot and Mouth Disease，HFMD)是亚太地区最常见的传染病之 一，在过去几十年中导致了许多起死亡事故。该病主要通过与体液（例如唾液）接触来传 播。大多数肠道病毒是HFMD的病原体。对患有HFMD的患者的预后可因引起HFMD的肠道 病毒而异。例如，肠道病毒，例如柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16，CA16)通常导致自 限性HFMD，而肠道病毒71(EV71)可引起神经系统并发症和死亡。
[0005] HFMD是温和瘆病的形式，其主要影响儿童并导致在手、脚和/或颊粘膜上出现水 疱皮瘆。有超过60种肠道病毒可引起HFMD。HFMD的主要病原体是属于小核糖核酸病毒 科（Picornaviridae family)的肠道病毒，即EV71、CA16、柯萨奇病毒B2(CB2)和艾柯病毒 (Echovirus) 7 (Echo7)。通常，由大多数肠道病毒引起的临床症状可以是相似的；因此，可能 难以仅通过单独观察临床症状来确定哪种肠道病毒引起了 HFMD。然而，EV71通常是可区分 的，这是由于其可导致神经系统并发症和死亡的异常毒力。可由EV71引起的神经系统并发 症包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、肺水肿和脊髓灰质炎样麻痹。
[0006] 最近在亚太地区大规模爆发的HFMD导致了 1998年在台湾的78人死亡，1997年 在马来西亚的41人死亡，2000年在新加坡的5人死亡，2006年在马来西亚的18人死亡以 及2008年在新加坡的2人死亡。所有上述的死亡事故都是由EV71引起的，并且在这些死 亡事故中的一些，发现患者共感染了 EV71和CA16。在2010年在中国的最近HFMD疫情中， 报道了由EV71引起的超过250, 000例HFMD病例，包括250起死亡事故。
[0007] 2010年在新加坡报道了超过19, 000例HFMD病例，其中12%的病例是由EV71引 起的。数量惊人的HFMD病例导致儿童看护中心和学校关闭，其最终影响了经济。
[0008] 迄今为止，还没有可用于治疗HFMD的有效抗病毒药物，并且没有可用于预防HFMD 的疫苗。目前，所有已知的HFMD治疗都是基于症状的并且具有尤其是针对EV71的最低效 力。目前还没有可用的有效抗病毒药物或疫苗，需要迅速并准确地鉴定HFMD患者，从而为 患者提供及时治疗和管理并减少感染的传播。
[0009] 此外，目前全科医生、健康看护专业人员和学校教师通常是基于视觉上可观察到 的症状（例如发烧、口腔溃疡和/或四肢（例如手和/或脚）上出现皮瘆）来进行分类、鉴 定和/或诊断患有HFMD或处于HFMD之早期阶段的儿童。这种诊断方法是非常主观的且 容易出现错误分类或误诊。HFMD可在儿童中迅速传播，特别是在人多的地方，例如学校；因 此，需要迅速并准确地鉴定HFMD患者以防止疾病的进一步传播。
【发明内容】
[0010] 本公开内容涉及利用特异性抗原-抗体相互作用的侧向流免疫层析测定。将含有 病毒的分析物添加到样品垫中，随后通过毛细管作用沿着测试条（test strip)流动。所述 测试条包含检测分子，其中所述检测分子包含与胶体金（即，胶体金纳米颗粒）相缀合的第 一特异性抗体。当病毒遇到检测分子时，与胶体金相缀合的第一特异性抗体识别病毒的病 毒抗原，其中所述病毒抗原包含特异性病毒表面蛋白（即，肠道病毒的VP1蛋白）。第一特 异性抗体与病毒的特异性病毒表面蛋白（即，肠道病毒的VP1蛋白）的第一区域相结合，以 形成包含抗体-抗原复合物的第一复合物。所述抗体-抗原复合物进一步向下迀移到测试 线（test line)上，所述测试线包含包被在测试线上的第二特异性抗体，其中第二特异性抗 体识别特异性病毒表面蛋白（即，肠道病毒的VP1蛋白）。第二特异性抗体与特异性病毒表 面蛋白（即，肠道病毒的VP1蛋白）的第二区域相结合。所述病毒与包被在测试线上的第 二特异性抗体相结合。第二特异性抗体与病毒的结合形成了包含抗体-抗原夹心复合物的 第二复合物。一种或更多种抗体-抗原夹心复合物的形成导致可见的或视觉可观察的红色 线的形成，这是由于作为胶体金纳米颗粒的胶体金检测分子具有红色。
[0011] 本公开内容的侧向流免疫层析测定以及使用其来检测肠道病毒的方法使得可在 30分钟或更短时间内以90%或更高的准确度迅速现场鉴定HFMD患者。本公开内容的侧向 流免疫层析测定以及使用其来检测肠道病毒的方法使得可进行有效且高效的患者管理并 降低任何误诊的可能性。
[0012] 本公开内容的第一方面提供了用于检测肠道病毒之存在的侧向流测试条（test strip)，其中，所述测试条可包含：缀合物垫，其包含多个检测分子；和测试线，其包含多个 捕获分子；其中所述测试条检测肠道病毒。
[0013] 在一些实施方案中，上述侧向流测试条可特异性地用于检测肠道病毒。在一些实 施方案中，上述侧向流测试条可100 %特异性地用于检测肠道病毒。
[0014] 在一些实施方案中，每个检测分子可包含与可检测颗粒相缀合的第一抗原特异性 抗体。在一些实施方案中，可检测颗粒可包含金纳米颗粒。在一些实施方案中，第一抗原特 异性抗体可对包含病毒表面蛋白的病毒抗原特异。在一些实施方案中，第一抗原特异性抗 体可对病毒表面蛋白的第一区域特异。在一些实施方案中，病毒表面蛋白可以是VP1蛋白。 在一些实施方案中，每个检测分子可包含一个或更多个第一抗原特异性抗体，其中每个所 述一个或更多个第一抗原特异性抗体可与可检测颗粒相缀合。
[0015] 在一些实施方案中，每个捕获分子包含第二抗原特异性抗体。在一些实施方案中， 第二抗原特异性抗体可对病毒表面蛋白特异。在一些实施方案中，第二抗原特异性抗体可 对病毒表面蛋白的第二区域特异。在一些实施方案中，病毒表面蛋白可以是VP1蛋白。
[0016] 在一些实施方案中，上述侧向流测试条可在约30分钟或更短时间内、约20分钟或 更短时间内或约10分钟内提供测试结果。在一些实施方案中，侧向流测试条可在约20分 钟或更短时间内提供测试结果。在一些实施方案中，上述侧向流测试条可在约10分钟内提 供测试结果。
[0017] 在一些实施方案中，上述侧向流测试条可提供准确度约90%或更高的测试结果。 在一些实施方案中，上述侧向流测试条可提供准确度约95%或更高的测试结果。在一些实 施方案中，上述侧向流测试条可提供准确度约99%或更高的测试结果。在一些实施方案中， 上述侧向流测试条可提供准确度约100%的测试结果。
[0018] 在一些实施方案中，肠道病毒可包括一种或更多种肠道病毒。
[0019] 在一些实施方案中，上述侧向流测试条可以是现场侧向流测试条。
[0020] 本公开内容的第二方面提供了制造上述侧向流测试条的方法，其中所述方法可包 括：制造缀合物垫；制备包含检测分子的检测分子溶液；以及将缀合物垫浸泡在检测分子 溶液中。
[0021] 本公开内容的第三方面提供了用于检测一种或更多种肠道病毒的诊断试剂盒，其 中所述诊断试剂盒包含上述侧向流测试条。
[0022] 在一些实施方案中，上述诊断试剂盒还包含用于收集生物流体样品的样品收集装 置。
[0023] 本公开内容的第四方面提供了使用侧向流免疫层析测定来确定肠道病毒之存在 的方法，其中所述方法可包括：提供样品；提供包含多个检测分子和多个捕获分子的侧向 流测试条；将样品添加到侧向流测试条的样品垫上；以及使样品暴露于多个检测分子。
[0024] 在一些实施方案中，每个检测分子可包含与可检测颗粒相缀合的第一抗原特异性 抗体。在一些实施方案中，可检测颗粒可包含金纳米颗粒。在一些实施方案中，每个检测分 子可包含一个或更多个第一抗原特异性抗体，其中每个所述的一个或更多个第一抗原特异 性抗体可与可检测颗粒相缀合。
[0025] 在一些实施方案中，第一抗原特异性抗体可对包含病毒表面蛋白的病毒抗原特 异，其中如果所述样品包含肠道病毒，则第一抗原特异性抗体可与病毒表面蛋白相结合以 形成一个或更多个第一复合物。在一些实施方案中，第一抗原特异性抗体可对病毒表面蛋 白的第一区域特异。在一些实施方案中，病毒表面蛋白可以是VP1蛋白。
[0026] 在一些实施方案中，每个捕获分子可包含第二抗原特异性