一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，属 酶工程中酶活检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 人体由肠道吸收摄入的乙醇，主要在肝脏内代谢。乙醇进入体内后，首先在乙醇脱 氢酶（ADH)的作用下使乙醇脱氢转化为乙醛，然后在由乙醛脱氢酶（ALDH)的催化作用下， 使乙醛氧化生成乙酸，乙酸通过三羧酸循环（TCA)分解为C02和水，并释放能量生成ATP。
[0003]
【主权项】
1. 一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于具体 包括以下步骤： (1) 、配制 〇? 01-0. 2mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH7. 0-9. 5 ; (2) 、激发波长为 320應-38〇11111，发射波长为44〇11111-48〇11111; (3) 、用pH7. 0-9. 5、浓度为0? 01-0. 2mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为 5XKT4-O. 39XKT5m〇l/L的辅酶1溶液，并测定辅酶I溶液荧光值，然后以辅酶I溶液荧 光值为横坐标、以辅酶I浓度为纵坐标，获得辅酶I溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准 曲线； (4) 、取细胞培养液经4°C、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3 倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎， 然后控制温度〇_6°C、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶 酶液； 所述的磷酸缓冲液按每升计算，含〇. 24gKH2PO4,1. 44gNa2HPO4, 8.OgNaCl，0. 2gKCl和余量的水； 或取血液作为粗乙醛脱氢酶酶液； 或组织匀浆液控制温度〇-6°C、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集的上清液作 为粗乙醛脱氢酶酶液； (5) 、将步骤（4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH7. 0-9. 0,0.Imol/LTris-HCl缓冲液、 1\10-3-5\10-3111〇1/1乙醛水溶液、0.1-0.5 111〇1/11((：1水溶液、5\10-4-1\10-3111〇1/1嫩0+ 水溶液和〇. 01-0. 〇5mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25-40°C保持 10-30min后，在激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm下，测定反应体系中粗 乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值； 所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：pH7. 0-9. 0,0?Imol/LTris-HCl缓冲液 2. 5-7. 5ml I X1〇-3-5Xl(T3mol/L乙醛水溶液 0? 1-0. 3ml 0? 1-0. 5mol/LKCl水溶液 0? 1-0. 3ml 5XKT4-IXKT3mol/LNAD+水溶液 0? 1-0. 3ml 0? 01-0. 05mol/L硫基乙醇水溶液 0? 03-0.IOml 粗乙醛脱氢酶酶液 0. 1-0. 3ml; (6) 、步骤（3)所得辅酶I溶液荧光值X和辅酶I浓度y之间标准曲线的线性方程为： y=0. 0686x-3. 6621，y的单位为IXl(T4mol/L 定义每生成〇? 0686Xl(T4m〇l/L辅酶I为一个酶活力单位U; 根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力； 酶活力单位（U/mL) =A荧光值/3 ; 其中A荧光值为步骤（5)中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是 反应体系总体积。
2. 如权利要求1所述的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的 方法，其特征在于： 步骤（1)中，Tris-HCl缓冲液浓度为0?lmol/L，pH8. 0 ; 步骤（2)中，激发波长为320nmnm，发射波长为440nmnm; 步骤（3)中，用pH7. 5、浓度为0?Olmol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为 5XKT4-O. 39XKT5m〇l/L的辅酶I溶液，并测定辅酶I溶液荧光值，然后以辅酶I溶液荧 光值为横坐标、以辅酶I浓度为纵坐标，获得辅酶I溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准 曲线； 所述的PH7. 5、浓度为0.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液通过包括如下步骤的方法制备而 成： I. 2114gTris喊溶于 900ml蒸馈水，加入 80. 6ml0.Olmol/LHCl，调pH至 7. 5,定容至 1000 rnl； 步骤（4)、取细胞培养液经4°C、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞 体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细 胞破碎，然后控制温度4°C、转速lOOOOr/min离心20min收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶 液； 所述的磷酸缓冲液按每升计算，含〇. 24gKH2PO4,1. 44gNa2HPO4, 8.OgNaCl，0. 2gKCl和余量的水； 步骤（5)中，将反应体系控制温度为25°C保持20min后，激发波长为320nm，发射波长 为440nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值； 所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：pH8. 0、浓度为 0?Imol/L的Tris-HCl缓冲液 2. 57ml 0? 05mol/L乙醛水溶液 0? Iml 3 mol/LKCl水溶液 0? Iml 0? 02mol/LNAD+水溶液 0?Iml I mol/L硫基乙醇水溶液 0? 03ml 粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml。
3.如权利要求1所述的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的 方法，其特征在于： 步骤（1)中，Tris-HCl缓冲液的浓度为0?lmol/L，pH8. 0 ; 步骤（2 )中，激发波长为380nm，发射波长为480nm; 步骤（3)中用pH7. 5、浓度为0.Olmol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为 5XKT4-O. 39XKT5mol/L的辅酶I溶液，并测定辅酶I溶液荧光值，然后以辅酶I溶液荧 光值为横坐标、以辅酶I浓度为纵坐标，获得辅酶I溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准 曲线； 步骤（4)中，取细胞培养液经4°C、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细 胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行 细胞破碎，然后控制温度4°C、转速lOOOOr/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶 酶液； 所述的磷酸缓冲液按每升计算，含〇. 24gKH2PO4,1. 44gNa2HPO4, 8.OgNaCl，0. 2gKCl和余量的水； 步骤（5)中，将形成的反应体系控制温度为30°C保持20min后，在激发波长为380nm， 发射波长为480nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变 化值； 所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：pH8. 0、浓度为 0?Imol/L的Tris-HCl缓冲液 2. 57ml 0? 05mol/L乙醛水溶液 0?Iml 3mol/LKCl水溶液 0?Iml 0? 02mol/LNAD+水溶液 0?Iml Imol/L硫基乙醇水溶液 0? 03ml 粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml。
4.如权利要求1所述的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的 方法，其特征在于： 步骤（1)中，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.lmol/L，pH8. 0 ; 步骤（2 )中，激发波长为340nm，发射波长为460nm; 步骤（3)中，用pH7. 5、浓度为0? 01m〇l/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为 5XKT4-O. 39XKT5mol/L的辅酶I溶液，并测定辅酶I溶液荧光值，然后以辅酶I溶液荧 光值为横坐标、以辅酶I浓度为纵坐标，获得辅酶I溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准 曲线； 步骤（4)中，取细胞培养液经4°C、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细 胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行 细胞破碎，然后控制温度4°C、转速lOOOOr/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶 酶液； 所述的磷酸缓冲液按每升计算，含〇. 24gKH2PO4,1. 44gNa2HPO4, 8.OgNaCl，0. 2gKCl和余量的水； 步骤（5)中，将步骤（4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、浓度为0.Imol/L的Tris-HCl缓 冲液、0? 05mol/L乙醛水溶液、3mol/LKCl水溶液、0? 02mol/LNAD+水溶液和Imol/L硫基 乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为35°C保持20min后，在激发波长为340nm，发 射波长为460nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化 值； 所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：pH8. 0、浓度为 0?Imol/L的Tris-HCl缓冲液 2. 57ml 0? 05mol/L乙醛水溶液 0?Iml 3mol/LKCl水溶液 0?Iml 0? 02mol/LNAD+ 水溶液 0?Iml Imol/L硫基乙醇水溶液 0? 03ml 粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml。
【专利摘要】本发明公开一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，即首先用Tris-HCl缓冲液将辅酶I配置成不同浓度梯度的辅酶I溶液，检测不同浓度的辅酶I溶液的荧光值，制作辅酶I浓度与荧光值相对应的标准曲线，将由粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0-9.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液等形成的反应体系控制温度为25-40℃保持10-30min后，在激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm下测定反应体系中粗乙醛脱氢酶酶液酶液每分钟的荧光变化值，最后依公式酶活力单位=△荧光值/3来计算乙的醛脱氢酶酶活力单位。该测定方法操作简便，灵敏度高。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104792760
【申请号】CN201510214484
【发明人】龚钢明, 魏晓聪, 吴范宏
【申请人】上海应用技术学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月29日