利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物快速检测技术，具体涉及一种利用量子点荧光强度变化检测凋亡过程中线粒体膜通透性改变的方法。
【背景技术】
[0002]线粒体在细胞凋亡中起着关键性的调控作用，而线粒体膜功能的改变与此过程密切相关，线粒体膜透化(mitochondrial membrane permeabilizat1n, MMP)在不同程度上改变线粒体内膜及外膜，被认为是许多程序性细胞死亡过程的早期阶段。在此过程中，外膜通透性改变引起细胞色素C (Cyt C)、凋亡诱导因子(AIF)等膜间蛋白的释放，引发凋亡过程；内膜通透性改变导致线粒体跨膜电位(△ Ψπι)降低，基质渗透性膨胀，进而引起外膜破裂，并促进膜间蛋白释放从而引发凋亡。因此，对上述内外膜变化的检测，有助于凋亡的早期识别。
[0003]虽然目前有多种方法可检测线粒体外膜通透性改变，但各自均有不足。如对膜间蛋白亚细胞定位的检测，采用免疫印迹法和ELISA法检测虽然检测灵敏，但试剂成本高；电子或荧光显微镜法虽然直观，但易产生假阳性结果；细胞荧光测定法虽然结果可靠但操作过程复杂。另外高压液相色谱法、质子核磁共振法也对仪器条件和人员技术有较高要求。而现有方法对线粒体内膜通透性改变的检测，主要利用可透过内膜的脂质阳离子荧光染剂对Λ Ψπι进行检测，通过检测跨膜电位的变化反映内膜通透化。常用的脂质阳离子荧光染剂主要包括罗丹明及其诱导物——Rhol23、TMRE、TMRM、CMXRos，以及羰花青类一 JC_l、D1C6 (3)等。Rhol23应用较为广泛，可在短时间内被吸收并达到平衡，但在高浓度下有猝灭效应，而TMRE, TMRM可在较低浓度下使用，达到快速累积，无明显猝灭效应，相对于Rhol23有着较强的优势。CMXRos的优势在于它能在功能线粒体中浓聚，并在细胞固定过程中得到较好的保存。尽管Rhol23、TMRE, TMRM和CMXRos都易被有功能的线粒体摄取，但一旦线粒体膜电位消失，就会从细胞中被洗出，从而限制了他们在需醛类或其它影响线粒体能量代谢的物质固定的细胞中的应用。JC-1在低浓度下(0.1 mM以下水溶液)，以绿色荧光单体形式存在，在较高浓度下则以红色聚合物形式存在，红/绿荧光比率可用于Δ Ψπι测定，此检测方法较敏感，受线粒体大小、形态、密度等干扰因素影响较少。Di0C6(3)是最常用于ΛΨπι测定的羰花青类染剂，但其荧光强度部分受细胞大小、质膜电势的影响。综上所述线粒体膜透化的检测方法各有优点和不足，加上检测内膜透化的脂质阳离子荧光染剂还普遍具有毒性方面的缺点，因此能提供一种方便、灵敏、稳定、低毒或无毒且相对快速检测凋亡过程中线粒体膜透化的方法，对补充或替代传统检测方法具有重要意义。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，采用最佳缓冲液配方配制水溶性量子点检测试剂，按步骤检测凋亡过程中线粒体膜透化的改变。
[0005]进一步的，所述量子点为巯基乙酸或巯基丁二酸等羧基修饰的低毒水溶性量子点。
[0006]进一步的，所述低毒水溶性量子点包括CdS、CdSe, CdTe, CdTe/ZnSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnTe。
[0007]进一步的，所述缓冲液含225mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖，且pH在7.5-8.5范围的D-Hank’ s缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、PBS缓冲液。
[0008]进一步的，检测步骤包括:(I)制备线粒体悬液；(2)加入量子点检测试剂，冰浴10分钟；(3)荧光读数。
[0009]本发明所用量子点能灵敏、稳定检测出凋亡过程中线粒体膜透化的改变，与电子显微镜法和Rhol23法基本吻合，检测步骤相对简单，并缩短检测时间。
【附图说明】
[0010]图1为正常组与凋亡组线粒体的电子显微镜图；
图2为正常组与凋亡组线粒体的Rhol23法检测结果；
图3为正常组与凋亡组线粒体的量子点法检测结果。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图对本发明作进一步说明。
[0012]量子点(Quantum Dots，QDs)是一种由II ~ V!族或III ~ V族元素组成的，直径在1-1OOnm之间的半导体纳米颗粒，由于电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。基于量子点独特的荧光性能，
本发明的利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，采用最佳缓冲液配方配制水溶性量子点检测试剂，按规定步骤检测凋亡过程中线粒体膜透化的改变。
[0013]本发明所述的量子点为巯基乙酸或巯基丁二酸等羧基修饰的低毒水溶性量子点(CdS、CdSe、CdTe、CdTe/ZnSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnTe )，配制量子点检测试剂所用的储存缓冲液含225mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖，且pH在7.5-8.5范围的D_Hank’ s缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、PBS缓冲液。检测过程基本步骤包括:(I)制备线粒体悬液；(2)加入量子点检测试剂，冰浴10分钟；(3)荧光读数。
[0014]本发明的利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，通过以下实验例加以说明。
[0015]本发明通过采用CCL4染毒小鼠构建肝损伤模型，取材肝脏并分离线粒体制备悬液，用CdTe量子点检测线粒体膜透化的改变，取得较好的检测效果。
[0016]1.材料和方法
1.1构建小鼠肝损伤模型及制备肝线粒体
健康ICR雄性小鼠随机分为正常组和CC14染毒组。正常组小鼠按0.lml/10g剂量腹腔注射植物油，染毒组注射60mg/kg CC14，24 h后，取小鼠肝脏，在预冷的0.25mol/L蔗糖-Tris.HCl (pH7.4)溶液中剪碎、洗净、匀浆，700Xg离心10 min，取上清液，10000 X g，4°C离心15min，沉淀用预冷的蔗糖溶液清洗后再1000Xg离心15min，所得沉淀即为线粒体，采用Bradford法进行线粒体总蛋白定量。
[0017]1.2量子点荧光检小鼠肝测线粒体膜透化
正常组和CC14染毒组小鼠线粒体悬液按lmg/mL重悬于Iml缓冲液(含225mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖、5mmol/L HEPES, pH=7.2)中，分别加入5uL CdTe量子点检测试剂后，冰浴10分钟，直接测定两组线粒体悬液的相对荧光强度。以传统方法电子显微镜观察和Rhl23荧光探针法检测结果作为对照。
[0018]2实验结果
量子点荧光检测小鼠肝线粒体膜透化结果显示(如图3所示)，CC14染毒组较正常组的相对荧光强度显著上升(P〈0.01)，与电子显微镜观察(如图1)和Rhl23荧光探针法检测结果吻合(如图2所示)。
[0019]3 结论
采用CdTe量子点荧光检测法能准确指示出凋亡过程中线粒体膜透化的改变，与电子显微镜观察法、Rhl23荧光探针法相比，检测步骤相对简单，并缩短检测时间。
【主权项】
1.一种利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，其特征在于:采用最佳缓冲液配方配制水溶性量子点检测试剂，按步骤检测凋亡过程中线粒体膜透化的改变。
2.如权利要求1所述的利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，其特征在于:所述量子点为巯基乙酸或巯基丁二酸等羧基修饰的低毒水溶性量子点。
3.如权利要求2所述的利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，其特征在于:所述低毒水溶性量子点包括0(15、0(156、0(?^、0(?^/21156、0(?^/2115、0(156/211丁6。
4.如权利要求1或2所述的利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，其特征在于:所述缓冲液含225mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖，且pH在7.5-8.5范围的D-Hank’ s缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、PBS缓冲液。
5.如权利要求1或2所述的利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法，其特征在于:检测步骤包括:(I)制备线粒体悬液；(2)加入量子点检测试剂，冰浴10分钟；(3)荧光读数。
【专利摘要】本发明公开了一种利用量子点荧光检测凋亡过程中线粒体膜透化改变的方法。本发明所述的量子点为巯基乙酸或巯基丁二酸等羧基修饰的低毒水溶性量子点，包括CdS、CdSe、CdTe、CdTe/ZnSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnTe，配制量子点检测试剂所用的储存缓冲液含225mmol/L甘露醇、70mmol/L蔗糖，且pH在7.5~8.5范围的D-Hank’s缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、PBS缓冲液。检测过程基本步骤包括：（1）制备线粒体悬液；（2）加入量子点检测试剂，冰浴10分钟；（3）荧光读数。本发明能灵敏、稳定检测出凋亡过程中线粒体膜透化的改变。
【IPC分类】G01N21-64
【公开号】CN104792761
【申请号】CN201510226045
【发明人】胡华军
【申请人】中国计量学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月6日