一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析和生物检验技术领域，具体涉及一种平面色谱与微孔板阵列 映射关联实验方法及其应用，该实验方法是一种从中药等中药及天然产物复杂组分中中快 速分离、活性评价和分析鉴定的一体化方法，用于中药及天然产物复杂组分中中活性组分 的初步筛选及其活性检验。
【背景技术】
[0002] 天然产物是潜在的药用资源化合物库，人类致力于从中筛选、研宄和开发新药的 努力从来没有间断过。目前常规的方法大都采用植化方法以有机溶剂对天然产物进行系 统分离，对每个分离出的组分进行浓缩或分取，再转入微孔板中进行活性检测，对于组分复 杂、含量差异巨大的天然产物来说，无异于竭泽而渔，耗时耗力。因此，在活性指导下的天然 产物中活性成分的筛选对天然药用资源的研宄与开发意义重大。
[0003] 现阶段，国内外针对天然产物中活性化合物的快速筛选的前沿方法多采用流动色 谱分离方法、如逆流色谱、液相色谱，将载有色谱分离组分的色谱流动相与微量活性试验方 法(如MTT、ELISA以及免疫荧光试验等）结合进行活性评价，从中筛选出活性成分。这些分 离筛选方法，相对于常规的植化方法有一定的进步，但是依然面对很多问题。
[0004] 对于逆流色谱、液相色谱等流动色谱分离方法来说，考虑到分离方法对不同结构 特性物质的适应性、不同检测方法及其检测条件对不同结构特性物质的选择性与灵敏度、 以及收集的组分的体积和浓度，对于组分结构复杂、含量差异巨大的天然产物来说，要分离 出每一个组分、识别每个色谱峰、实现每个峰的切割和收集，难度很大，即使大部分实现也 会带来巨大的工作量和耗费。
[0005] 而平面色谱法（Plane Chromatography)因可在色谱图上进行原位反应而独具特 色，是一种可集分离、鉴定和活性检测于一体的分析方法。免疫印迹技术通过电泳与免疫反 应结合进行活性大分子的分析与检测，已经发展成蛋白质、核酸等生物活性大分子研宄不 可缺少的工具。薄层色谱（TLC)生物自显影方法也在生物活性分子筛选中得到应用[E.G. Bj0rseth A， Gether J， Landmark L， iteller M， Detection of mutagens in complex samples by the salmonella assay applied directly on thin-layer chromatography plates，Science. 215 (1982) 87-89.]，但由于薄层色谱的分离介质会给后续的生物活 性反应带来干扰或妨碍而受到一定限制。如何保留平面色谱的分离特性、去除分离介质而 又能方便地对分离出的成分进行生物活性实验，成了 TLC与生物活性反应结合的关键。 [0006] 免疫印迹技术采用亲电的硝基膜转移生物大分子在这方面取得了满意的 结果[I. M. Chomaj E. M. Grzelakj Bioautography detection in thin-layer chromatography， Journal of Chromatography Α· 1218 (2011) 2684-2691·]，但 TLC 生 物自显影方法却碰到了许多困难：TLC色谱组分大多水溶性差，化合物不易进入水溶性培 养基介质，难以进行抑菌或抗菌实验[A. Marston，Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry, Journal of Chromatography A. 1218 (2011)2676-2683. ] ;TLC分离介质（如硅胶、氧化铝或纤维素等)干扰或妨碍生物活性反应， 会带来大量的背景和噪音，降低检测的灵敏度和选择性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种平面色谱与微孔板阵列映 射关联实验方法。
[0008] 本发明的另一个目的是提供平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法的应用，特 别是在中药及天然产物复杂组分中活性组分的检测和筛选中的应用。
[0009] 本发明利用平面色谱法对中药及天然产物复杂组分中等混合物中的组分具有分 离、原位记载和可视定位的特点，采用阵列映射的方法建立起平面色谱斑点与微孔板试验 孔之间的关联关系，并依此阵列映射关联关系将被分离的色谱斑点整体地洗脱并转移到对 应的微孔板试验孔上进行多种活性实验。该方法既保留了平面色谱的特性、又将色谱分离 出的组分从平面色谱的分离介质中释放出来，避免了分离介质对后续的生物活性实验等带 来的可能干扰或妨碍，将色谱分离、活性反应和化合物追踪检测关联起来，使色谱分离、活 性反应和分析检测既可独立操作又可作为一个整体进行观察、研宄和关联分析，可实现活 性指导下的中药及天然产物复杂组分中活性成分的快速筛选、以及对复杂组分生物活性的 现场检验。本发明对中药及天然产物复杂组分中活性成分的检测和筛选具有微量、快速、简 捷、直观和经济的特点，并极大地减少了有机溶剂使用。
[0010] 本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现： 一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法，包括以下步骤： 51. 配制样品溶液并进行薄层色谱分析； 52. 薄层色谱显色及色谱参数采集； 53. 薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系的确定； 54. 依照薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，将色谱斑点洗脱与转移至微孔板相应 的实验孔里，得到微孔板样本； 55. 重复步骤Sl和S4,平行制备多个微孔板样本； 56. 采用平行微孔板样本对相应的各色谱斑点组分进行生物活性实验以及必要的化 学分析； 57. 依据薄层色谱斑点与微孔板阵列映射关系，对显示出生物活性的色谱斑点组分的 化学成分进行追踪分析，对其生物特性、化学成分、含量以及结构信息进行对比研宄和关联 分析，探索其量-效和构-效关系，初步筛选出活性成分。
[0011] 本发明步骤Sl配置样品溶液并进行薄层色谱分析为本领域常规技术，将天然产 物提取物、中药提取物或含有多种化学成分的混合物样品配制成待测溶液，选择合适的薄 层色谱固定相和色谱流动相进行一维或二维薄层色谱分析。
[0012] 本发明先基于一维薄层色谱与微孔板之间的阵列映射关系，初步评价各薄层色谱 条带组分对应的生物活性，考察活性实验的平行性、样品的上样量以及生物活性组分的分 布情况。在此实验基础上，再基于二维薄层色谱与微孔板阵列映射关系，在活性指导下作进 一步的分离、活性检测和活性成分筛选。
[0013] 所述薄层色谱分析使用的薄层色谱板的载体为玻璃、塑料、金属薄膜或纸。
[0014] 本发明步骤S2薄层色谱显色及色谱参数采集采用本领域常规技术，作为一种具 体的实施方案，所述薄层色谱显色的方法包括喷洒显色试剂显色、碘熏显影显色或在紫外 光下观察成像并作标记，所述色谱参数包括色谱斑点的Rf值和峰面积，可用作色谱鉴别和 半定量分析。
[0015] 具体地，所述薄层色谱显色可以利用常规方法下观察到的色谱斑点与薄层色谱载 体中含有的成分相互作用产生的特定颜色(如硅胶GF254薄层板在254nm光下检视到的色 谱斑点），或利用常规方法已知的显色剂及其相应方法对色谱斑点进行原位反应产生的颜 色特点（如以硫酸-香草醛的乙醇溶液为显色剂喷洒在硅胶薄层板上、经约l〇5°C加热产生 的色谱斑点)。
[0016] 本发明将所述微孔板是以多个小池(试验孔）作为实验小试管排列成的阵列；建立 起薄层色谱中各个色谱斑点与微孔板阵列映射关联关系，并依此关系将色谱斑点洗脱转移 至相应的微孔板实验孔中，可得到含有色谱斑点并保留薄层色谱特征的微孔板样本；这些 微孔板样本可用于ELISA、MTT检测和DNA