在新生儿的筛查中诊断半乳糖血症的方法
【专利说明】在新生儿的筛查中诊断半乳糖血症的方法 发明领域
[0001] 本发明公开通过测定在生命的5-7天之前采取的来自新生儿的血液样品中的 GAL-I-P浓度诊断半乳糖血症的方法。
[0002] 一般背景
[0003] 半乳糖血症是危及生命的先天性代谢缺陷。其由酶半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 (GALT)中的缺陷引起。GALT在半乳糖的代谢中是重要的且其在半乳糖-1-磷酸（GAL-I-P) 向葡萄糖-6-磷酸（GLC-6-P)的转化中催化重要步骤。在具有半乳糖血症的患者中该转化 非常低或不存在，导致GAL-I-P及其代谢物的有害的水平。
[0004] 在很多国家中半乳糖血症筛查是国家新生儿筛查项目的一部分。目前，酶活性测 试（即Beutler测试）是用于半乳糖血症筛查的主要方法（BeutlerE,BaludaMC.Asimple spotscreeningtestforgalactosemia.JLabClinMedl966 ;68:137-141)〇Beutler 测试的主要优点是其测量酶活性而不是代谢物浓度。主要缺点是其要求酶活性是完整无缺 的。酶对热是敏感的且可以通过过多的热量被致使失活，因此导致假阳性。此外，Beutler 测试需要属于其自身的样品。不可能使其与其他的筛查测试多路复用（multiplex)。
[0005] 当筛查半乳糖血症时还可能使用代谢物作为生物标记物。使用质谱法筛查半乳 糖血症基于的生物标记物先前已在W00210740中被描述。简要地，升高的水平的磷酸己糖 (hexose-monophosphate)被用作疾病的生物标记物。这基于半乳糖血症导致GAL-I-P的 升高的水平的事实，所述GAL-I-P是磷酸己糖。理想地，筛查应当单独地基于GAL-1-P。然 而，在质谱法（MS)中不可能区分不同类型的磷酸己糖。在质谱法测定之前使用液相色谱 法（LC-MS)以便区分它们是可能的，但由于高的样品处理量的需求，这在新生儿筛查中是 不切实际的。使用总的磷酸己糖作为生物标记物的合理性是在具有半乳糖血症的患者中 GAL-I-P水平变得升高超过所有的其他磷酸己糖的水平。总的磷酸己糖的异常浓度明确地 指示半乳糖血症。此方法在检测接收含有半乳糖的食物的患者上是有效的。母乳、牛奶以 及基于奶的食物包含由通过1，1-葡萄糖苷键连接的半乳糖和葡萄糖单元组成的乳糖。其 在消化道中迅速地转化为半乳糖和葡萄糖。因此正常饮食的新生儿暴露于高水平的半乳糖 且如果他们患有半乳糖血症，他们的GAL-I-P水平将显著地增加。
[0006] 然而，在出生时若干类型的磷酸己糖以低水平存在于新生儿中，主要是GLC-6-P。 GLC-6-P的存在引起在总的磷酸己糖测定中的本底水平，这转而对筛查方法的特异性和灵 敏性具有有害影响。为了使磷酸己糖方法适当地起作用，GAL-I-P的水平必须大体上超过 GLC-6-P的水平以便能够检测阳性样品。虽然GAL-I-P的水平在具有半乳糖血症的患者中 在出生时升高，但该水平仅在摄食包含半乳糖的食物若干天后显著地上升。通常，稳态在出 生后3至5天之后获得。在取样之前必须使孩子已经摄食大量的半乳糖的事实是筛查中的 主要缺点。在许多国家中新生儿筛查样品在3至5天之前采取，此外，某些新生儿具有喂食 问题并且在较晚的时间达到稳态水平。
[0007] 如早前所提到，GAL-I-P的水平在半乳糖血症患者中在出生时已经升高。如果由 GLC-6-P的存在广生的本底可以被除去，在新生儿中筛查半乳糖血症将是可能的。本发明提 供化学地消耗GLC-6-P而不影响GAL-I-P的手段，从而使得可以使用质谱法测量GAL-I-P而不依赖于取样时间筛查半乳糖血症。另外的优点是用MS的新生儿筛查允许多路复用，即 在一个样品中可以组合若干筛查测试。
[0008] 4.发明概述
[0009] 本发明使得GAL-I-P水平的分析是更特定的。除去干扰化合物允许使用质谱法筛 查半乳糖血症的新生儿中的GAL-IP水平的更特定的且因此更精确的测定。当研宄来自尚 未实现GAL-IP的稳态的孩子的样品时（即在生命的5-7天之前），这是至关重要的。
[0010] 5.发明的详细公开内容
[0011] 本发明公开通过修饰磷酸己糖的羰基来测定来自新生儿的早期血液样品中的 GAL-I-P浓度的方法。羰基的修饰通过氧化、还原或与胺反应进行。
[0012] 羰基的还原优选地通过将硼氢化钠添加到样品中来实现且羰基的氧化优选地通 过使样品与硝酸或托伦斯试剂或费林试剂反应来实现。羰基优选地通过使样品中的磷酸己 糖与肼反应被修饰。肼选自N2H4、单甲基肼、1，1-二甲基肼、1，2-二甲基肼、异烟肼、异丙烟 肼、肼苯嘆、苯乙肼、2, 4-二硝基苯肼或苯肼。
[0013] 来自新生儿的样品通常在出生后3-5天被收集，但根据目前的方法，样品仅在刚 刚出生后可以被收集。血液样品中的GAL-I-P浓度优选地通过质谱法测量。
[0014] 本发明基于在1位没有被修饰的所有的糖的化学消耗。单糖处于直链和环的形式 之间的平衡。此平衡基于被称为正位异构化的过程，其中5位羟基与糖的1位形成键，产生 在酮基位置和1位之间的氧桥（图1)。醛基随后形成羟基。在直链形式中糖是远远更有反 应性的，因为酮基的氧比碳水化合物的其他的氧（当其作为羟基存在时）远远更有反应性。 当将官能团添加到在1位（在1位修饰）的糖时，不再可能将其转化为直链形式且其被锁 定在环的形式中。当糖被锁定在环的形式时其不再具有酮反应性。
[0015] 在本发明中，允许主要与醛和酮反应但不与羟基反应的试剂在分析之前与样品反 应。在1位没有被修饰的所有的糖将反应且形成其他的化合物。
[0016] 这允许消耗GLC-6-P而不影响GAL-I-P的水平。这意味着在反应后GLC-6-P将不 再存在于样品中。因此只有1-修饰的磷酸己糖将有助于测量总的磷酸己糖。本发明利用 在1位被修饰的糖的羰基（即醛基或酮基）被保护以免化学反应的事实。使用的化学反应 靶向羰基而不影响羟基中的氧。有可以被利用的大量的熟知的化学反应。其通常落在以下 的类别中：对技术人员将是熟知的羰基的还原或氧化或与胺的反应。
[0017] 羰基的还原，例如硼氢化钠还原。NaBH4将还原多种有机羰基，将酮和醛转化为醇。 对醛和酮的金属氢化物还原和有机金属加成，二者均减小羰基碳的氧化态，且可被分类为 还原。如注意的是，其通过强的亲核性物质在亲电性碳上的进攻进行。羰基化合物向醇或 向烃的其他有用的还原可通过不同的机制发生。例如，氢化（Pt、PcUNi或Ru催化剂）、与 乙硼烷的反应、以及通过在羟基或胺溶剂中的锂、钠或钾还原都已经被报告将羰基化合物 转化为醇。然而，对于这种转换，络合的金属氢化物通常是优选的，因为其以高收率给出较 清洁的产物。
[0018] 羰基的氧化，例如硝酸、托伦斯试剂或费林试剂。羰基的碳原子具有相对高的氧化 态。这反映在描述的大部分反应到现在为止未引起氧化态的改变（例如缩醛或亚胺形成） 或产生还原（例如有机金属加成和脱氧）的事实。最常见和特色的氧化反应是将醛转化为 羧酸。优选的氧化试剂是作为氧化剂的Ag(+)和Cu(2+)。
[0019] 与胺的反应，例如席夫碱形成或与肼的反应。醛和酮与氨或1°_胺反应形成亚胺 衍生物（也被称为席夫碱（具有C=N官能的化合物））。用于修饰糖中的1位的羰基（即 醛基或酮基）的优选的胺是肼（N2H4),但可以使用任何的肼衍生物：多种被取代的肼是已知 的，且若干种自然地发生。某些实例包括：
[0020] ?单甲基肼，其中肼分子上的氢原子中的一个已被甲基（CH3)替换。由于肼分子 的对称性，哪个氢原子被替换并不重要。
[0021] ? 1，1-二甲基肼（非对称的二甲基肼，UDMH)和1，2-二甲基肼（对称的二甲基 肼）是其中两个氢原子被甲基替换的肼。
[0022] ?异烟肼、异丙烟肼、肼苯哒嗪和苯乙肼是分子包含肼状结构的化合物。
[0023] ? 2, 4-二硝基苯肼（2, 4-DNPH)通常用于测试有机化学和临床化学中的酮和醛。
[0024] ?苯肼，C6H5NHNH2,被发现的第一种肼。
[0025] 这些反应产生具有不同分子质量的化合物且因此可以容易地通过质谱法被区分。 这使得可以测定GAL-I-P的升高的水平而不依赖于半乳糖暴露。串联质谱法被广泛地用于 新生儿筛查，这是由于在单个样品中可以同时分析各种各样的化合物的事实。这使得可以 在单次分析中筛查大量的疾病。被引入到筛查的任何化学反应应该优选地不干扰对其他分 析物的分析。为了实现这个，我们选择使用肼，然而任何羰基特定的试剂都可以用于改进半 乳糖血症筛查其本身。
[0026] 在新生儿筛查中，肼被广泛地用于使筛查酪氨酸血症成为可能。在这种情况下，肼 被用于释放蛋白质结合的琥珀酰丙酮以便其可以通过质谱法被测定。这个方法的原因是在 酪氨酸血症中产生过多的琥珀酰丙酮。升高的血液琥珀酰丙酮水平将是酪氨酸血症的吸引 人的生物标记物，然而琥珀酰丙酮迅速地与血液中存在的大量的蛋白质反应。琥珀酰丙酮 与蛋白质形成共价键。肼以如此的方式反应以破坏与蛋白质的键，因此释放琥珀酰丙酮。以 这种方式，琥珀酰丙酮可以被用作生物标记物，不管其对蛋白质的反应性。肼的这个用途从 根本上与我们在半乳糖血症筛查利用的用途不同。我们使用肼以降低干扰化合物的水平， 然而在酪氨酸血症中的肼的功能是增加生物标记物的水平。
[0027] 肼被认为不干扰用于新生儿筛查的其他的生物标记物。因此肼是用于半乳糖血症 筛查的吸引人的试剂，因为其改进方法的灵敏性和选择性而不干扰其他的新生儿筛查分析 物。
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