微生物分析的设备和方法
【专利说明】微生物分析的设备和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 该申请要求于2013年4月30日提交、申请序列号是No. 13/874213的美国专利申 请"Apparatusandmethodsformicrobiologicalanalysis" 的优先权。该申请还要求 于 2012 年 5 月 1 日提交的，发明人是JamesL.Stephenson、Jr.，OksanaGvozdyak、Roger Grist、ClayCampbell和IanD.Jardine，申请序列号是No. 61/687785的美国临时专利申 请"Apparatusandmethodsformicrobialanalysisanddirectedempirictherapy" 的优先权，通过引用将其全文结合至本公开。
【背景技术】
[0003] 近年来，质谱分析与传统的鉴定微生物的方法相比，由于其准确性提高，获得结果 的时间缩短，成为流行的鉴定微生物的手段。到目前为止，微生物鉴定中最常用的质谱分析 方法是基质辅助的激光解吸附离子化时间飞行（MALDI-T0F)质谱分析。在MALDI-T0F中， 未知微生物细胞与合适的紫外光吸收基质溶液混合，并在样品板上干燥。或者，用微生物细 胞的提取物取代完整细胞。转移至质谱仪的离子源之后，激光束照射至样品进行蛋白质的 解吸附和离子化，并收集随时间变化的质谱数据。
[0004] MALDI-T0F法产生的微生物的质谱显示了来自完整肽、蛋白质和蛋白质片段的大 量尖峰，其构成了该微生物的"指纹"。该方法依赖于未知微生物的质谱尖峰图与参考数 据库的匹配，所述参考数据库包括采用基本相同的实验条件所获得的已知微生物的图谱集 合。分离的微生物和参考数据库中的某个图谱的匹配越好，则将该微生物鉴定是属、种、（或 在某些情况下）亚种级的可信度就越高。由于该方法依赖于MALDI-T0F质谱中尖峰图的匹 配，其不需要鉴定或者另外表征在该未知微生物图谱中表示的蛋白质以鉴定该微生物。
[0005] 尽管MALDI-T0F法快速、成本高效，其仍然具有缺陷从而限制了其应用范围。基 质辅助激光解吸附离子化（MLDI)质谱中的信息内容反映了含量最高的、可离子化的蛋 白质，除了病毒，在所采用的实验条件下，所述蛋白质通常局限于核糖体蛋白质。由于核糖 体蛋白质在原核生物中是高度保守的（conserved)，因此，MALDI-T0F对紧密相关的微生 物的区分是有限的。而且，株型鉴定（strainidentification)和/或血清型鉴定、抗生 素耐受性、抗生素敏感性、毒力（virulence)或其它重要特征的确定取决于蛋白质标记物 而不是核糖体蛋白质的检测，其进一步限制了MALDI-T0F在微生物分析中的应用。采用 MALDI-T0LF鉴定微生物的实验室必须采用其它方法以进一步表征被鉴定的微生物。另外， MLDI-TOF法对质谱形状匹配的依赖要求纯的培养物，以获得高质量结果，其通常不适用于 直接测试含有不同微生物的样品。
[0006] 已经采用了若干其它的质谱分析法以检测微生物。例如，已经描述了基于质谱的 蛋白质测序方法，其中液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS)，从源自微生物样品的蛋白质 的酶分解物获得序列信息。该方法，称为"由下至上（bottom-up)"的蛋白质组学是被广泛 应用的蛋白质鉴定方法。该方法可以提供亚种或株型级的鉴定，这是因为，色谱分离允许对 核糖体蛋白质之外的其它蛋白质进行检测，包括有利于对抗生素耐受性标记物和毒力因子 进行表征的蛋白质。所述由下至上的方法的主要缺陷是获得结果的时间延长，这是因为，需 要对蛋白质进行分解、长时间的色谱分离和数据处理。因此，该方法不适用于高产出量处 理。
【发明内容】
[0007] 本发明包括一种用于在从培养物分离之后或者直接从样品对微生物进行鉴定的 新方法和系统，其中所述方法和系统是基于通过高分辨率/质量准确性的单级（MS)或多级 (MSn)质谱来对微生物的蛋白质进行表征。本公开采用基本适用于几乎所有微生物的方法 和高分辨率/质量准确的单级（MS)或多级（MSn)质谱，还讨论了对毒力因子、抗生素耐受 性标记物、抗生素敏感性标记物或其它特征的目标检测和评估。尽管以下讨论集中于通过 蛋白质表征来鉴定微生物，但是本公开所述的方法和系统同等适用于通过对一种或多种小 分子、脂类或碳水化合物等的表征来鉴定微生物。
[0008] 一方面，本发明提供了一种传统由下至上蛋白质组学方法的替代方法，即通 过基本适用于几乎所有微生物的方法对源自微生物细胞的完整蛋白质进行由上至下 (top-down)的分析，所述微生物包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、支原体、 酵母菌、病毒和丝状（即显微镜可见的）真菌。本发明提供了对含有微生物混合物的样品 中的微生物在属、种、亚种、致病株型、甚至是血清型级的鉴定，和/或对直接来自纯的和/ 或混合培养物以及直接样品（例如表面拭子、体液等）的微生物进行鉴定。另外，可以采用 该方法对毒力因子、抗生素耐受性和敏感性标记物或其它特征进行目标检测。本发明的方 法简单且快速，这是因为，不需要对样品进行化学或酶分解，而且实时进行数据处理。
[0009] 示例性方法包括两阶段工艺。在第一阶段，样品中微生物的可溶蛋白质被快速提 取，并经质谱仪分析，以便基于对一种或多种被提取的可溶蛋白质的分子量和片段分析来 鉴定微生物。第一阶段在几分钟之内完成，例如少于10分钟，少于5分钟或大约1分钟之 内或更少。第二阶段采用快速色谱（rapid,time-compressedchromatography)分离和质 谱分析（例如目标MS和MSn)以进一步表征在第一步中鉴定的微生物，例如通过确定毒力 因子、抗生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物或其它特征来表征。第二阶段在几分钟之 内完成，例如少于15分钟，少于10分钟，或大约5分钟之内或更少。两个阶段均依靠对源 自微生物的完整蛋白质的检测和鉴定，不需要将蛋白质进行化学、物理或酶降解至它们的 取代肽。
[0010] 对样品中一种或多种微生物进行鉴定和表征的另一示例性方法包括以下步骤： (a)采用质谱分析进行第一分析方法，以对一种或多种微生物中的每一个检测和鉴定一种 或多种（例如，一、二、三、四、五种或更多）蛋白质；(b)利用上述来自一种或多种微生物中 的每一个的一种或多种蛋白质的身份，进一步确定样品中的至少一种微生物；（c)利用来 自步骤（b)的信息从预定义的分析方法列表中自动选择第二分析方法，第二分析方法也采 用质谱分析；以及（d)对样品执行第二分析方法，以确定样品中是否存在指示抗生素耐受 性标记物、抗生素敏感性标记物和/或毒力因子的蛋白质，以及任选地，对样品中存在的抗 生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物和/或毒力因子进行定量。
[0011] 目标微生物包括但不限于：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、支原体、 酵母菌、病毒和丝状真菌。表征过程可以包括检测感兴趣的微生物所产生的毒力因子、耐受 性标记物、抗生素敏感性和任何其它分子，包括但不限于影响临床结果的那些分子。该方法 适用于大量的不同类型样品，包括源自临床样品的纯的或混合培养物的样品，包括但不限 于：血、尿、粪便、痰、伤口和体表拭子，还适用于其它来源的样品，包括工业或环境样品，例 如食品、饮料、土壤、水、空气和表面拭子。
[0012] 本发明的方法包括下述步骤中的至少一个或多个：微生物细胞破碎、蛋白质溶解、 样品清洗（脱盐、去除不可溶组分和碎片、和/或浓缩）、注入样品或流动注射、快速部分液 相色谱分离、溶液中蛋白质的离子化、MS和MS/MS模式的高分辨率/质量准确性的多级质 谱分析、经分子量分析和/或蛋白质测序分析的微生物鉴定。
[0013] 本发明的方法和样品制备试剂盒提供了执行该方法的装置。如一个实施例中所考 虑的，快速提取程序之后跟着进行在线（on-line)清洗和直接分析。在另一实施例中，快速 提取之后对完整蛋白质进行快速部分液相色谱分离。之后，蛋白质被离子化，例如被电喷雾 离子化。完整蛋白质进行MS和MSn分析，从而根据需要将微生物鉴定至属、种、株型、亚种、 致病型或血清型级。MS或MSn法可以采用直接测序或图形匹配法进行病原鉴定。在采集过 程中实时执行该鉴定过程。其也可以在采集之后进行。该系统进一步提供了对毒力因子、 耐受性标记物、抗生素敏感性标记物和/或例如与疾病相关的任何其它相关标记物的定量 检测和鉴定。
[0014] 由于采用有限的一组试剂来执行通用方法，本发明的方法适于在进行样品制备和 质谱分析的全自动系统内使用。
[0015] 理想地，从样品制备至结果报告自动执行本发明的方法。结果可以自动传至医院 电子医疗记录系统，结果可以在此直接与患者治疗方案、保险、帐单联系起来，或用于流行 病学报告。该综合系统有利于对医院、局部、区域和全球范围内的疾病爆发进行流行病学追 踪。对于高产出量的实验室，多个系统可以与中央计算机连接，所述中央计算机在报告之前 对来自不同仪器的数据进行整合。该系统能够引入表型易感性数据，该数据可以与本发明 生成的鉴定、毒力、抗生素耐受性和分型信息结合起来。
[0016] 通过以下说明书和所附的权利要求，本发明的这些和其它目标和特征将变得完全 显而易见，或者可以通过下文所述的本发明的实施被了解。
【附图说明】
[0017] 为了进一步阐明本公开内容的上述和其它优势和特征，通过参考特定实施例，对 本公开内容进行尤其详细的描述，用附图对所述实施例进行说明。应当认识的是，这些附图 仅仅用于举例说明本公开内容的实施例，因此不能被认为是对其范围的限制。通过采用以 下附图对本公开内容进行特别和详细地描述和解释，其中：
[0018] 图IA是用于描述鉴定微生物的方法的流程图；
[0019] 图IB是示意性描述了鉴定微生物的算法的流程图；
[0020] 图2是示意性描述了对来自至少一种微生物的可溶蛋白质进行快速提取和分析 的系统从而鉴定所述至少一种微生物的框图；
[0021] 图3是示意性描述了根据图2所示系统的一个实施例所能采用的一个流路图；
[0022] 图4描述了经直接注入而得到的大肠杆菌提取物的全扫描电喷雾质谱；
[0023] 图5描述了图4所示的大肠杆菌提取物在50道尔顿（Da)窗口的质量分离；
[0024] 图6描述了图5所示的50道尔顿的窗口的串联质谱；
[0025] 图7描述了大肠杆菌的脱氧核糖核酸（DNA)结合蛋白质H-sn的+19的电荷状态 的MS/MS碎片；
[0026] 图8A-8F描述了对从地衣芽孢杆菌（BacillusIicheniformis)、白念珠菌 (Candidaalbicans)、大肠杆菌（Escherichiacoli)、玫瑰色库克菌（Kocuriarosea)、木 糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus)和包皮垢分支杆菌（Mycobacteriumsmegmatis) 提取出的可溶蛋白质进行快速部分色谱分离的质谱数据；
[0027] 图9A显示的MS数据描述了在标准生长条件和在苯唑西林存在下生长18小时的 耐抗生素大肠杆菌（ATCC35218)之间的比较；
[0028] 图9B显示的MS数据描述了图9A的在标准生长条件和在乙氧萘青霉素存在下生 长18小时的耐抗生素大肠杆菌之间的比较；
[0029] 图9C显示的MS数据描述了图9A的在标准生长条件和在青霉素存在下生长18小 时的耐抗生素大肠杆菌之间的比较；
[0030] 图9C显示的MS数据描述了图9A的在标准生长条件和在阿莫西林存在下生长18 小时的耐抗生素大肠杆菌之间的比较；
[0031] 图10描述了来自白假丝酵母菌的四种不同蛋白质的高分辨率/质量准确性的经 提取的离子图谱；
[0032] 图11A-11C描述了 34摄氏度下、在Oxoid原装胰酶大豆琼脂上生长20小时的各 种微生物的快速部分分离质谱（FPCS-MS)总离子电流图谱。（A) -大肠杆菌ATCC8739; (B) -鹌鹑肠球菌ATCC700425; (C) -枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种ATCC6633;以及
[0033] 图12描述了源自于由图IlA所示、在34摄氏度下、在Oxoid原装胰酶大豆琼脂上 生长20小时的大肠杆菌ATCC8739的FPCS-MS所得信息的蛋白质去卷积质量。
【具体实施方式】
[0034] 在一个实施例中，本