虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产养殖与营养研宄领域，具体涉及虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定 方法。
【背景技术】
[0002] 水产养殖虾蟹类饲料中添加用油大都富含多种脂肪酸，对于如何评判哪种脂肪酸 更利于机体有效利用的研宄，目前并无报道。在传统营养研宄中，如果通过长期投喂某种脂 肪酸的方式来评判机体对脂肪酸的利用效率，是不可行的，原因在于单一脂肪酸不利于机 体生长、存活、繁殖，而且成本较高。如果通过长期饲喂富含某种脂肪酸的饲料，研宄机体对 脂肪酸的利用效率，由于营养的不均衡也是无法科学客观反应机体对脂肪酸的利用效率。 因此，采用贝塔（以下用β描述）测定方法可以灵敏精确的测定机体对某种脂肪酸的利用 效率。
[0003] 饥饿状态下，机体主要由线粒体内的脂肪酸贝塔氧化为相应的组织器官提供能 量。一般通过测定线粒体β氧化的标志酶β羟乙酰-CoA脱氢酶（HAD)的最大活性来衡 量肌肉或肝脏组织中脂肪酸氧化的效率，但是在这个复杂的β氧化循环反应中，涉及很多 种酶，如果测定单一酶在整个循环过程中的活性是不可能的。所以通过测定鲜活组织匀浆 液的脂肪酸β氧化效率，可以精确反应相应组织脂肪酸氧化的效率。
[0004] 在自然状态下，虾蟹类经常会受到饥饿、缺氧或药物的胁迫，必然影响机体的代谢 能力，所以通过测定机体的脂肪酸β氧化效率，可以间接灵敏的评判机体的生存状态。
[0005] 缺点：此方法的应用前景是非常广泛的。但是，此方法在实施过程中也有一些不 足：比如，并没有对脂肪酸氧化过程中产生的 14CO2 (据报道，14CO2约占大鼠肌肉匀浆中，标 记棕榈酸降解产物的1% -30% ;大鼠肝脏匀浆中，140)2占标记棕榈酸降解产物的很少）进 行测定。
[0006] 现有的传统养殖技术无法灵敏准确测定某种脂肪酸对虾蟹类的利用效率，此方法 通过14C标记脂肪酸在体外组织中的β氧化效率，可以精确灵敏反应组织对某种脂肪酸的 利用效率，进而反应机体对脂肪酸的利用效率。推而广之，利用某一种脂肪酸（例如：棕榈 酸），通过体外测定其在组织中的β氧化效率，也可以作为评判机体代谢效率的，生存状态 的一个灵敏指标。另外，体外测定组织对脂肪酸的β氧化效率，主要在人、小鼠、牛、羊、鱼 类等脊椎动物中进行研宄，在甲壳类中没有相关应用，没有对于此类相关实验材料、条件摸 索的相关报道，此方法提供的流程对研宄人员进行相关研宄具有极高的参考价值。
【发明内容】
[0007] 本发明提出了一种虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法，包括以下步骤：
[0008] ①配置用于线粒体和过氧化物酶体反应的第一反应体系；配置用于抑制线粒体活 性的第二反应体系；
[0009] ②分别向所述第一反应体系、所述第二反应体系中加入虾蟹匀浆液，进行反应；
[0010] ③分别向所述第一反应体系、所述第二反应体系中加入反应终止剂，过夜，抽滤并 取抽滤的上清液，加入闪烁液；
[0011] ④用入液闪仪测定其放射性强度，从而得到虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率。
[0012] 其中，所述反应终止剂包括HCLO4等。
[0013] 本发明虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中，所述第一反应体系包含线粒体和 过氧化物酶体反应所需的生物能量、酶类、缓冲液和螯合剂。
[0014] 所述第一反应体系包含：80 ~85mM KC1，15 ~18mM MgC12,0. 5 ~0. 9mM EGTA， 12 ~14mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，12 ~14mM DTT，3 ~6mM ΑΤΡ，0· 1 ~0· 2mM NAD+，0. 1 ~ 0.2mM C〇A，0.4~0.6mM L-肉碱，0.4~0.6mM L-苹果酸，23~25"]?细胞色素(：，以及 40~50nM被14C标记的脂肪酸溶液。
[0015] 优选地，所述第一反应体系包含：83. 3mM KC1，16. 7mM MgCl2,0. 7mM EGTA，13. 3mM H印es (4-羟乙基哌嗪乙磺酸），13. 3mM DTT，5mM ATP，0· 2mM NAD+，0· 2mM CoA，0· 5mM L-carnitine(肉喊），0.5mM L_malate(苹果酸），25μΜ cytochrome-c(细胞色素 C)和 50nM被14C标记的脂肪酸溶液。
[0016] 本发明虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中，所述第二反应体系包含过氧化物 酶体反应所需的生物能量、酶类、缓冲液、螯合剂和抑制剂。
[0017] 所述第二反应体系包含：80 ~85mM KC1，15 ~18mM MgC12,0. 5 ~0. 9mM EGTA， 12 ~14mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，12 ~14mM DTT，3 ~6mM ΑΤΡ，0· 1 ~0· 2mM NAD+，0. 1 ~ 0. 2mM CoA，2~3mM KCN，0. 2~0. 4mM鱼藤酮，以及40~50nM被14C标记的脂肪酸溶液。
[0018] 优选地，所述第二反应体系包含 83. 3mM KC1，16. 7mM MgCl2,0. 7mM EGTA，13. 3mM H印es (4-羟乙基哌嗪乙磺酸），13. 3mM DTT，5mM ΑΤΡ，(λ 2mM NAD+，(λ 2mM CoA，2. 6mM KCN， 0. 38mM rotenone (鱼藤酮），和50nM被14C标记的脂肪酸溶液。
[0019] 本发明虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中，所述被14C标记的脂肪酸溶液包 含被 14C标记的脂肪酸与牛血清蛋白；预先将被14C标记的脂肪酸：牛血清蛋白（BSA)按1~ 1. 5:0. 5~1 (摩尔比）单独配制成被14C标记的脂肪酸溶液，然后，再分别加入至第一或第 二反应体系中。优选地，所述被 14C标记的脂肪酸与牛血清蛋白的摩尔比为3: 2。
[0020] 本发明虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中，所述被14C标记的脂肪酸包括但 不限于被 14C标记的棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、或花生四烯酸等之任意一种。在一具体 实施例中，例如，所述被14C标记的脂肪酸为被 14C标记的50nM棕榈酸、50nM油酸、50nM亚油 酸、50nM亚麻酸或50nM花生四烯酸。
[0021] 本发明虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中，所述虾蟹匀浆液包括蟹或虾的肝 胰腺或肌肉、以及蔗糖匀浆液；所述虾蟹匀浆液由蟹和/或虾的肝胰腺或肌肉以及蔗糖匀 浆液混合冰浴制成。具体地，所述虾蟹匀浆液包括含有蟹的肝胰腺与蔗糖匀浆液、或含有 蟹的肌肉与蔗糖匀浆液、或含有虾的肝胰腺与蔗糖匀浆液、或含有虾的肌肉与蔗糖匀浆液、 等。
[0022] 其中，蔗糖匀浆液是指用于虾蟹组织进行匀浆的PH = 7的缓冲液，其含有0. 24~ 0. 26M蔗糖溶液、8~IOmM缓冲液和1~2mM螯合剂。其中，所述缓冲液包括Tris-cl溶液； 所述螯合剂包括EGTA溶液。所述蔗糖溶液包含蔗糖和蒸馏水。
[0023] 其中，蟹和/或虾的肝胰腺与蔗糖匀浆液的摩尔比为1~2 :10~20。优选地，为 1:10〇
[0024] 其中，蟹和/或奸的肌肉与蔗糖匀衆液的摩尔比为1~2 :10~30。优选地，为 1:20〇
[0025] 本发明虾蟹类脂肪酸贝塔氧化速率测定方法中，所述步骤②中，所述反应是在 25°C~35°C水浴环境中分别在第一反应体系、第二反应体系中进行的。
[0026] 所述步骤②中，奸或蟹的肝胰腺与鹿糖勾衆液的反应时间为30min~60min，优 选地，持续反应60min。所述反应是指虾或蟹的肝胰腺加入蔗糖匀浆液中进行冰浴匀浆， 制得虾或蟹的肝胰腺组织匀浆液，将此匀浆液迅速加入第一反应体系中进行反应30min~ 60min，优选反应60min，然后立刻向此反应液中加入终止液例如HCLO 4，终止反应。
[0027] 所述步骤②中，奸或蟹的肌肉与鹿糖勾衆液的反应时间为30min~60min，优选 地，反应持续30min。所述反应是指虾