高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物饲料的检测领域，特别是一种高精度测量猪尿中的克仑特罗含量 的方法。
【背景技术】
[0002] 样品前处理是分析检测过程的关键环节，是浓缩被测定的痕量组分，提高方法的 灵敏度，及除去对分析系统有干扰的物质的重要手段。萃取是从样品集体中分离出目标化 合物的一项技术，是样品预处理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是应用最广泛的 样品制备方法之一，但是，传统的液液萃取的操作繁琐费时、有机溶剂消耗量大，而且容易 出现乳化现象的缺陷，使得在实际应用中具有一定的局限性。
[0003] 1998年，科学家提出了在传统的液液萃取的基础上，利用一种具有吸附性和较大 的比表面积的惰性多空填料作为介质，建立的一种新型高效样品的制备方法-介质液液萃 取（supported liquid extraction简称SLE)，SLE萃取技术就是选用一种多孔性惰性材 料-煅烧硅藻土作为介质，取代分液漏斗，增大了两相接触时的作用面积，实现高效、快速 的萃取过程。
[0004] 当水溶液样品加样到固定的聚丙烯注射管中的煅烧硅藻土上后，经过一定时间 (一般分为几分钟），水相溶液以一层薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，将有机溶剂 从柱管上端加入，当互不相溶的两相在硅藻土表面接触的同时萃取立即发生，最后萃取液 在重力作用下流出，必要情况下，可以施加较小的压力，而水相保留在介质中。盛接的流出 液直接将溶剂吹干，复溶后，即可用于下一步分析检测。
[0005] 农业部1025号公告-11-2008公开了猪尿中β -受体激动剂多残留检测，其采用 酶解后异丙醇-乙酸乙酯进行萃取，并通过内标法可以得到相关的检测结果，但是在实际 应用中，采用酶解后然后在采用传统方法萃取后通过色谱检测有时无法检出残留项。如何 提高猪尿中的克仑特罗含量的测量精度是本领域技术人员需要考虑的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种分离效果好、有利于后续测试工作进行的高精度测量 猪尿中的克仑特罗含量的方法。
[0007] 本发明的技术方案为：一种高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，包括以下 步骤：
[0008] 步骤1 :样品预处理；收集猪尿，并加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍于 猪尿体积的2mol/L的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液；
[0009] 步骤2 :将上清液加入到SLE柱后，静置2~4分钟；
[0010] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗 的洗脱液；
[0011] 步骤4 :采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测，同时采用不同浓度 的克仑特罗标准溶液绘制标准回归曲线，所述的高效液相色谱法的具体参数为：
[0012] 色谱柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID
[0013] 柱温：室温
[0014] 流动相：0. 05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0. 05%磷酸水溶液和乙腈的体 积比为100:12 ;
[0015] 检测器：UV检测器；
[0016] 检测波长：2IOnm;
[0017]进样量：5〇yL;
[0018] 其中，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸 甲酯的重量比为1:0. 5~1。
[0019] 在上述的采用SLE法分离饲料中的克仑特罗的方法中，所述的猪尿为lg，缓冲溶 液为4ml，步骤2中所取的上清液为0. 5ml，所述的步骤3中，每次洗脱时所用的洗脱剂为 0. 5ml 〇
[0020] 在上述的采用SLE法分离饲料中的克仑特罗的方法中，所述的三氯乙酸和猪尿的 质量比为1:98~100。
[0021] 在上述的采用SLE法分离饲料中的克仑特罗的方法中，所述的步骤1中，漩涡混合 器混合处理的时间为0. 5~1分钟。
[0022] 在上述的采用SLE法分离饲料中的克仑特罗的方法中，所述的步骤1中，所述的离 心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000~11000转/分钟的速度离 心0· 5~1分钟。
[0023] 在上述的采用SLE法分离饲料中的克仑特罗的方法中，所述的SLE柱为奥秘山东 科技有限公司生产的介质液液萃取SLE柱，所述的高效液相色谱法所采用的仪器型号为 LC-2010型高效液相色谱仪。
[0024] 本发明的有益效果如下：
[0025] 采用SLE法分离猪尿中的克仑特罗，省略掉酶解步骤，并且采用缓冲溶液进行混 合，然后通过SLE柱分离出克仑特罗，萃取剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯，本发明的分离效率 好、分离时间短，同时结合HPLC法测量萃取得到的洗脱液，能够准确的测量猪尿中的克仑 特罗的含量，本发明的洗脱剂与传统的洗脱剂相比，其测量精度提高了 9.99%。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合【具体实施方式】，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对 本发明的任何限制。
[0027] 实施例1
[0028] 步骤1 :收集猪尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的2mol/L 的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和猪尿的质 量比为1:99 ;所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以10000转 /分钟的速度离心0.8分钟。
[0029] 步骤2 :将上清液加入到SLE柱（奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE 柱）后，静置3分钟；
[0030] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗 脱液；每次消耗的洗脱剂为〇. 5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0. 8。
[0031] 实施例2
[0032] 步骤1 :收集猪尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的2mol/L 的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和猪尿的质 量比为1:98 ;所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000转/ 分钟的速度离心1分钟。
[0033] 步骤2 :将上清液加入到SLE柱（奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE 柱）后，静置2分钟；
[0034] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗 脱液；每次消耗的洗脱剂为〇. 5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:1。
[0035] 实施例3
[0036] 步骤1 :收集猪尿1ml，并加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4ml的2mol/L 的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和猪尿的质 量比为1:99 ;所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以10000转 /分钟的速度离心0.5分钟。
[0037] 步骤2 :将上清液加入到SLE柱（奥秘山东科技有限公司生产的介质液液萃取SLE 柱）后，静置4分钟；
[0038] 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱2次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗 脱液；每次消耗的洗脱剂为〇. 5ml，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，乙 酸乙酯和乙酸甲酯的重量比1:0. 5。
[0039] 标准样的制备
[0040] 称取克仑特罗标准品（纯度彡99% )0· OlOOg，置于1000 ml容量瓶中，用重量比为 1:0. 8的乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物的溶剂溶解定容，其浓度为10 μ g/ml ;
[0041] 取上述浓度为10 μ g/ml的克仑特罗溶液于1000ml容量瓶中，配制成为2 μ g/L、 5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L 的标准样。
[0042] 对比例I
[0043] 与实施例1大体相同，不同的地方在于，步骤3中，洗脱剂为异丙醇与乙酸乙酯的 混合物，其体积比为60:40。
[0044] 分析：
[0045] 检测方法具体为：
[0046] 仪器：LC-2010型高效液相色谱仪（日本岛津）
[0047] 色谱柱：C18 柱，I5Omrn*3. 9HimID
[0048] 柱温：室温
[0049] 流动相：0. 05%磷酸水溶液：乙腈=100:12 ;
[0050] 检测器：UV检测器；
[0051] 检测波长：2IOnm;
[0052] 进样量：50 μ L
[0053] 以2 μ g/L、5 μ g/L、8 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L的标准样进行测试，回归方程为Y = 10750X+0. 5, R2= 0. 9991，X为待测物浓度，Y为峰面积。
[0054] 取同一份猪尿1kg，按照实施例1的方法制备10份萃取样品A标号为A1-A10,按 照对比例1的方法制备10份萃取样品B标号为B1-B10。
[0055] 按照上述检测方法进样检测，得到如下的检测结果：
【主权项】
1. 一种高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1 :样品预处理；收集猪尿，并加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入4倍猪尿体 积的2mol/L的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液； 步骤2 :将上清液加入到SLE柱后，静置2~4分钟； 步骤3 :采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，每次洗脱时所用的洗脱剂为0. 5ml，接 收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液； 步骤4 :采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测，同时采用不同浓度的克 仑特罗标准溶液绘制标准回归曲线，所述的高效液相色谱法的具体参数为： 色谱柱：C18 柱，150mm*3. 9mmID 柱温:室温 流动相：〇. 05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0. 05%磷酸水溶液和乙腈的体积比 为 100:12 ; 检测器：uv检测器； 检测波长：210nm ; 进样量：50yL ; 其中，所述的二元洗脱剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合物，其中乙酸乙酯和乙酸甲酯 的重量比为1:0. 5~1。
2. 根据权利要求1所述的高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所 述的猪尿为lg，缓冲溶液为4ml，步骤2中所取的上清液为0. 5ml。
3. 根据权利要求1所述的高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所 述的三氯乙酸和猪尿的质量比为1:98~100。
4. 根据权利要求1所述的高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所 述的步骤1中，漩涡混合器混合处理的时间为0. 5~1分钟。
5. 根据权利要求4所述的高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，其特征在于，所 述的步骤1中，所述的离心处理的具体操作为：将经混合处理的溶液在离心机中以9000~ 11000转/分钟的速度离心0. 5~1分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法，包括以下步骤：步骤1：样品预处理；收集猪尿，并加入三氯乙酸沉淀猪尿中的蛋白质，加入80％VOL的2mol/L的乙酸铵缓冲液，漩涡混合器混合后离心；取离心后的上清液；步骤2：将上清液加入到SLE柱后，静置2～4分钟；步骤3：采用二元洗脱剂对SLE柱洗脱至少两次，接收洗脱液，得到含有克仑特罗的洗脱液，步骤4：采用高效液相色谱法对步骤3得到的洗脱液进行检测。本发明的目的在于提供一种分离效果好、有利于后续测试工作进行的高精度测量猪尿中的克仑特罗含量的方法。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104807909
【申请号】CN201510238890
【发明人】陈学松, 郭振旺, 黄蘅, 吴岚, 邓水德, 黎志锐
【申请人】广西壮族自治区梧州食品药品检验所
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月12日