外周血血浆蛋白质结构的拉曼、红外或拉曼-红外分析及其与阿尔茨海默氏症的认知发育 ...的制作方法
【专利说明】外周血血浆蛋白质结构的拉曼、红外或拉曼-红外分析及 其与阿尔茨海默氏症的认知发育的关系 发明领域
[0001] 本发明涉及通过振动光谱法（FT-拉曼、FT-红外或FT-拉曼组合FT-红外）分析 血浆蛋白质的新方法，从而证明二级和三级蛋白质结构与阿尔茨海默氏症（AD)的认知发 育之间存在相关性，主要应用领域是健康领域。本发明具体地涉及基于振动光谱法诊断AD 的诊断方法，并且其还可有助于与该光谱法仪器相关的商业领域。
[0002] 发明背景
[0003] 预计患有痴呆的人数，在2000年世界范围内有2500万，由于人口结构变化和寿命 增加，将在2030年增加至6300万并在2050年增加至1亿1400万。存在广泛的复杂神经 变性障碍，其特征均在于神经元功能失调最终导致神经元死亡，这与这些疾病发展相关。阿 尔茨海默氏症（AD)是最常见的。已计算出超过一半痴呆患者患有AD，并且这个数字将每 二十年翻倍。虽然神经变性痴呆的临床症状通常与最受影响的脑区域有关，但混合病理的 发作是普遍的，并且早期临床表现通常是相似的。此外，单一类型的病理可能产生不同的认 知结果，使得诊断艰难。存在证据证明表示痴呆的疾病病理变化在首次临床表现发作之前 数十年就开始。找到AD和其他痴呆的有效治疗的挑战与探索临床前变化的尽可能早的检 测和准确鉴定负有责任的病理（一个或多个）并行。
[0004] 因此，这些考虑对社会和健康系统提出巨大的挑战，以及因此提出允许早期检测 这些疾病从而给予适当治疗和准确跟踪其进展的生物标记的研宄的需要。当前最有效决 定性AD诊断限于尸检，并且临床诊断通过在专家分析痴呆是否存在并且未找到解释痴呆 病因的征兆或症状后的排除完成。有三个领域其中已经在理论上或在实践上获得可用于建 立如下诊断测试的结果：遗传学、生物标记检测/定量、神经成像。这些方式全部一一其中 一些非常昂贵，如神经成像一一已经取得一定成功，但仍未提供在医疗实践中需要的超过 80 %的诊断可靠度和特异性的诊断方案。AD提出很多问题，包括早期诊断和跟踪患者进展、 以及确定性死后诊断和神经病理变化表征。这些全部需要建立灵敏的、可靠的、简单实施和 重复的和低成本的方法。
[0005] 即使AD的病因是未知的并且正在讨论关于导致AD最终神经变性阶段的"一个 /多个致病事件的一个/多个级联"，但关于退化过程一一发生从而能够限定指示疾病的 可能的生物标记一一有着足够的知识。众所周知AD的最重要的病理特征其中之一是脑 中的纤维状蛋白质的积累，其表现为（神经元外）衰老斑和（神经元内）神经原纤维缠 结形成一一其主要组分是Af3 -淀粉状肽。一些作者已经证实外周血一一其是容易提取 的生物学流体一一中一些淀粉状肽的浓度与疾病特定阶段或患病风险相关，在一些情况 下具有预测价值（Graff-Radford等，Arch.Neurol. 64, 354-62 (2007) ;Baranowska_Bik 等，Neuro.Endocrinol.Lett. 29, 75-79 (2008);Modrego等，Am.J.AlzheimersDis.Other Demen. 23,286-290(2008))。在其他研宄中，已发现某些与氧化应激有关的生物标记， 自由基或过氧化大分子（血细胞的脂质、蛋白质、DNA)或生成或中和自由基的系统（超 氧化物歧化酶等），在阿尔茨海默氏症患者的血液中增加（Baldeiras等，Alzheimers Dis. 15, 117-128 (2008);Bermejo等，FreeRad.Res. 42, 162-170 (2008);Greibelger等，FreeRad.Res. 42, 633-638(2008))〇
[0006] 在大量研宄实验室诊断技术中，振动光谱法具有快速、非侵入性和相对低成 本的优势。其还提供关于生物学系统分子组分的分析和结构信息，这使其可用于这些 应用。拉曼光谱法已被用于AD诊断，通过测量脑组织的光谱、淀粉状0肽沉积物、胆 固醇的增加和高磷酸化tau蛋白--其被发现作为生物学变化（Archer等，European ConferenceonBiomedicalOptics(ECBO)，慕尼黑，德国，2007;Chen等，Appl.Optics48， 4743-4748(2009))。然而，该工作忽略了这种技术在检测脑组织的AD中的特异性和灵敏 性，此外该组织不如外周血般可获得，而外周血已知是容易提取的生物学流体。此外，脑组 织中发生的变化不一定在外周血中也要发生。
[0007] 拉曼光谱法也已以AD诊断为目的被用于研宄外周血血小板（Chen等，Laser Phys.Lett. 8,547_552(2011))。然而，该文章的确显现下列缺陷：
[0008] _633nm激发激光线的使用，如同其他可见光谱的激光线，可在生物学物质中产生 荧光，其至少部分地遮盖在议样品的拉曼光谱，并且使其随后的分析无用。由于拉曼共振效 应，利用可见光谱激光线的拉曼激发可引起有色少数血浆组分（类胡萝卜素、胆红素、血红 蛋白）的带大幅强化，这可很大程度上遮盖该部分的多数组分（蛋白质、脂质）。而且，如果 这些有色少数组分的含量飘忽不定，则随后的强拉曼信号也会飘忽不定，这将因此使得正 确的样品分类复杂。因此，需要使用更实用的激光用于诊断目的，和与傅立叶变换-拉曼光 谱仪（FT-拉曼光谱仪）相关的近红外激发，使多数样品的荧光概率最小化（Applications ofVibrationalSpectroscopyinPharmaceuticalResearchandDevelopment". Chichester，WestSussex，英国，2007, 353-362)。
[0009] _在该文章中通过拉曼光谱法分析的血小板样品来自转基因小鼠，其蛋白质与 人蛋白质不一致。因此，这些啮齿动物的AD进程中的分析-结构变化可能与人外周血中 发生的那些不同，如本发明中已经证明。此外，所述光谱法血小板研宄中的样品尺寸很 小（10个AD小鼠和8个健康对照），和当前患有AD的小鼠转基因模型中没有一个可与患 有该疾病的人类完全可比（Wisniewski和Sigurdssson，Biochim.Biophys.Acta1802， 847-859(2010))〇
[0010] 进而并且以诊断AD为目的，还已利用单核白细胞的透射红外（IR)光谱法 (Carmona等，Anal.Bioanal.Chem.402,2015-2021(2012))。通过利用 0 折叠结构百分比 作为单一诊断参数，在分类属于健康对照组以及患有轻度、中度和重度AD的患者组的样品 时所得灵敏度接近80 %。然而，从这个意义来讲，单独红外光谱法相对于可如下描述的拉曼 光谱法具有缺陷。即使在室温下在干燥样品中发现少量的水，其也导致850cm1以下的背景 吸收遮盖了在议样品的生物学物质的带。这意味着在红外中可用于样品分析的光谱范围短 于在拉曼中，因此提供较少信息。此外，在大分子结构的固有因素和光谱法选择规则中，必 须指出红外是提供关于二级蛋白质结构信息，而非关于包含色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、胱 氨酸/半胱氨酸的侧链的三级结构信息的技术。
[0011] 因此，需要建立能够发现与阿尔茨海默氏症相关的认知恶化关联的血液蛋白质结 构和氧化应激模式、能够更精确地区分所述疾病的状态的分析技术。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明涉及外周血血浆样品的拉曼、红外或拉曼/红外分析以及与阿尔茨海默氏 症的认知发育的相关性。如实施例1和2所示，现有的血液样品分级可用于实施本发明的方 法，这些分级的样品被收集在肝素化管中并进行离心。将约50微升的上清液沉积在样品盛 放器上并在室温下干燥约30分钟。在均质化后测量所得固体样品的拉曼光谱。使光谱标 准化，并且校正基线，从而随后确定由AD进程中淀粉状0肽形成和/或二级和三级蛋白质 结构的变化引起的光谱法参数（频率、带高度比和面积）变化。随后对光谱法参数进行判 别式分析，这基于使某些光谱区域与AD存在或不存在关联。拉曼光谱法中的这些区域是酰 胺I区域（nOO-ieOOcnT1)、980和910CHT1之间包括的区域（包括a-螺旋的一般C-C伸缩 带）、具有色氨酸残基的三级蛋白质结构的760-730CHT1区域、角变形的450-390CHT1区域、 和3100和2800CHT1之间包括的C-H伸缩区域。红外光谱法中适当的区域是蛋白质结构的 酰胺I区域（1700-160001^)和1150和lOOOcnT1之间包括的氧化应激区域。这些光谱区域 的光谱法参数的判别式分析能够以大于90%的灵敏度和特异性对来自健康对象或来自AD 患者的血浆样品进行分类。
[0014] 一方面，本发明涉及确定血液样品中与阿尔茨海默氏症的全面认知恶化相关的蛋 白质结构的振动光谱法，包括下列步骤：
[0015] a)记录事先获得的人血液样品的拉曼光谱；
[0016] b)获得下列拉曼光谱区域中至少一个的拉曼光谱数值：
[0017] R. 1. 1600和1700CHT1之间包括的区域；
[0018] R. 2. 910和980CHT1之间包括的区域；
[0019] R. 3. 730和760CHT1之间包括的区域；
[0020] R. 4. 390和450CHT1之间包括的区域；
[0021] 其中所述光谱数值选自带间拉曼强度比值、所述光谱区域面积值和/或频率值；
[0022] c)通过比较在步骤b获得的拉曼光谱值与允许在第I或II类之间进行区分的参 考光谱值，或通过多变量分析比较在步骤b获得的拉曼光谱值与第I类和第II类参考拉曼 光谱值，将血液样品分类至下列类别中的一种：
[0023] I.包含与阿尔茨海默氏症的非认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品；
[0024] II.包含与阿尔茨海默氏症的认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品。
[0025] 另一方面，本发明涉及确定血液样品中与阿尔茨海默氏症的全面认知恶化相关的 蛋白质结构的振动光谱法，包括下列步骤：
[0026] a)记录事先获得的人血液样品的红外光谱；
[0027] b)获得下列红外光谱区域中至少一个的红外光谱值：
[0028] IR. 1. 1600和1700CHT1之间包括的区域；
[0029] IR. 2. 1000和1150CHT1之间包括的区域；
[0030] IR. 3. 1140和1190CHT1之间包括的区域；
[0031] 其中所述红外光谱值选自所述光谱区域面积值、所述光谱区域强度比和/或所述 光谱区域带间面积百分比值；
[0032] c)通过比较在步骤b获得的红外光谱值与允许在第I或II类之间进行区分的参 考红外值，或通过多变量分析比较在步骤b获得的红外值与第I或II类参考红外光谱值， 将血液样品分类至下列类别中的一种：
[0033] I.包含与阿尔茨海默氏症的非认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品；
[0034] II.包含与阿尔茨海默氏症的认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品。
[0035]
[0036] 另一方面，本发明涉及鉴定容易接受适于治疗阿尔茨海默氏症的疗法的对象的方 法，包括通过振动光谱法确定血液样品中与阿尔茨海默氏症的全面认知恶化相关的蛋白质 结构，该振动光谱法包括
[0037] 1)下列步骤：
[0038] a)记录事先获得的人血液样品的拉曼光谱；
[0039] b)获得下列拉曼光谱区域中至少一个的拉曼光谱值：
[0040] R. 1. 1600和1700CHT1之间包括的区域；
[0041] R. 2. 910和980CHT1之间包括的区域；
[0042] R. 3. 730和760CHT1之间包括的区域；
[0043] R. 4. 390和450CHT1之间包括的区域；
[0044] 其中所述光谱值选自带间拉曼强度比值、所述光谱区域面积值和/或频率值；
[0045] c)通过比较在步骤b获得的拉曼光谱值与允许在第I或II类之间进行区分的参 考光谱值，或通过多变量分析比较在步骤b获得的拉曼光谱值与第I类和第II类参考拉曼 光谱值，将血液样品分类至下列类别中的一种：
[0046]I.包含与阿尔茨海默氏症的非认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品；
[0047] II.包含与阿尔茨海默氏症的认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品；
[0048] 和 / 或
[0049] 2)下列步骤：
[0050] a)记录事先获得的人血液样品的红外光谱；
[0051] b)获得下列红外光谱区域中至少一个的红外光谱值：
[0052] IR. 1. 1600和1700CHT1之间包括的区域；
[0053] IR. 2. 1000和1150CHT1之间包括的区域；
[0054] IR. 3. 1140和1190CHT1之间包括的区域；
[0055] 其中所述红外光谱值选自所述光谱区域面积值、所述光谱区域强度比和/或所述 光谱区域带间面积百分比值；
[0056] c)通过比较在步骤e获得的红外光谱值与允许在第I或II类之间进行区分的参 考红外值，或通过多变量分析比较获得的红外值，将血液样品分类至下列类别中的一种：
[0057] I.包含与阿尔茨海默氏症的非认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品；
[0058] II.包含与阿尔茨海默氏症的认知恶化相关的蛋白质结构的血液样品；
[0059] 其中如果包含该蛋白质结构的血液样品与阿尔茨海默氏症的认知恶化相关，则指 示所述对象容易接受适于治疗阿尔茨海默氏症的疗法。
[0060] 另一方面，本发明涉及本发明的方法用于获得血液样品中存在或不存在阿尔茨海 默氏症情况的指示的应用。
[0061] 另一方面，本发明涉及用于诊断对象的阿尔茨海默氏症的诊断方法，包括下列步 骤：
[0062] a)测量来自所述对象的血浆样品的拉曼光谱，获得至少一个拉曼带，该拉曼带选 自包括e-蛋白质结构的特异性振动的拉曼带、包括肽键角变形的特异性振动的淀粉状肽 的拉曼带、包括a-螺旋蛋白质结构的特异性振动的拉曼带和包括具有色氨酸残基的三级 蛋白质结构的特异性振动的拉曼带，和
[0063]b)比较在步骤a)获得的拉曼光谱与参考样品的光谱，
[0064] 其中指示相对于参考光谱蛋白质结构的特异性强度增加的拉曼光谱变动、 指示相对于参考光谱肽键角变形特异性强度增加的拉曼光谱变动、指示相对于参考光谱a_螺旋蛋白质结构特异性强度降低的拉曼光谱变动和/或相对于参考光谱三级蛋白质结 构中色氨酸残基的特异性振动产生的拉曼光谱变动，指示患者患有阿尔茨海默氏症。
[0065] 另一方面，本发明涉及用于诊断对象的阿尔茨海默氏症的诊断方法，包括下列步 骤：
[0066] a)测量来自所述对象的血浆样品的IR光谱，获得至少一个存在0 _蛋白质结构的 特异性带和/或至少一个指示存在氧化应激期间生成的化合物的特异性带，和 [0067]b)比较在步骤（a)获得的IR光谱与参考样品的光谱，
[0068] 其中指示相对于参考光谱0 _蛋白质结构增加的IR光谱变动和/或指示相对于 参考光谱在氧化应激期间样品中生成的化合物浓度增加的IR光谱变动，指示患者患有阿 尔茨海默氏症。
[0069] 另一方面，本发明涉及用于血浆样品分析的设备，包括：
[0070] (i)用于接收血浆样品的容器，
[0071] (ii)至少一个光谱仪，选自拉曼光谱仪和IR光谱仪，
[0072] (iii)计算机系统，包括用于实施根据本发明的诊断方法的工具。
[0073] 另一方面，本发明涉及计算机程序，包括适于进行根据本发明的诊断方法的代码。
[0074] 另一方面，本发明涉及包含本发明的计算机程序的数据载体。
[0075] 附图简述
[0076] 图1显示获自健康对照（a)以及患有轻度（b)、中度（c)和重度（d)AD的患者的外 周血血浆的3600-300CHT1区域中的拉曼光谱。
[0077] 图2显示获自健康对照（一）以及患有轻度（)和中度（......）AD的患 者的外周血血浆的1720-1600CHT1区域中的拉曼光谱。
[0078] 图3显不获自健康对照（一）以及患有轻度（---）和中度（......）AD的患 者的外周血血浆的450-380CHT1区域中的拉曼光谱。
[0079] 图4显示获自健康对照（一）以及患有轻度（一)、中度（......）和重度 .)AD的患者的外周血血浆的1000-900CHT1区域中的拉曼光谱。
[0080] 图5显示获自健康对照（一）以及患有轻度（---)、中度（......）和重度 (-? - ? - ? )AD的患者的外周血血浆的780-720CHT1区域中的拉曼光谱。
[0081] 图6显示来自老年对照（一）的血浆和来自中度（-----)AD患者的血浆的红外光 谱。（A):酰胺I区域。原始光谱（上）和以二阶导数表示的光谱（下）。⑶JlSO-lOOOcnT1 之间的区域。
[0082] 发明详述
[0083] 用于确宙与阿尔茨海默氏症的全而认知恶化相关的蛋白质结构的方法和用于诊 断阿尔茨海默氏症的方法
[0084] 根据本发明的方法，通过拉曼光谱法的分析应用，在获得用于确定AD的全面恶化 的方法和诊断AD的方法过程中的问题已被解决，拉曼光谱法提供与二级和三级蛋白质结 构有关的光谱参数，其结合红外光谱法技术进一步提供与氧化应激有关的另外的信息，如 本发明的实施例3至6所示。
[0085] 本发明基于如下发现：获自AD患者的血浆中的0折叠蛋白质结构和氧化应激 多于获自健康对照的血浆，而AD患者的a-螺旋结构含量相对于健康对照较低。此外， 这种疾病的全面衰退量表（GlobalDeteriorationScale，⑶S)与下列之间存在一定 相关性dTOO-ieOOcnT1 (酰胺I)之间和1150-lOOOcnT1之间的红外光谱谱线，以及酰胺 1(1700-160001^)区域、980和910CHT1之间包括的区域（包括独特的a-螺旋C-C伸缩 带）、具有色氨酸残基的三级蛋白质结构的760-730CHT1区域、角变形的450-390CHT1区域、 和3100和2800CHT1之间包括的C-H伸缩区域的拉曼光谱谱线。
[0086] 如前所述，拉曼光谱法提供关于二级蛋白质结构和关于包含色氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、胱氨酸/半胱氨酸的侧链的三级结构的分析-结构信息。有助于在来自健康对象和阿 尔茨海默氏症患者的血浆样品之间进行区分的因素，如本发明所示，不仅是酰胺I带，而且 是由具有色氨酸和其他的侧链的三级结构产生的带一一其处于500CHT1以下，是可检测的 拉曼光谱，但通过红外光谱法不可视。事实上，本发明的其中一个优势由首次检测到的、用 于样品分类的、可归属于淀粉状0肽的、500-400CHT1区域中的新参数或光谱法标记组成。 另一方面，红外光谱法还提供关于酰胺I区域中的蛋白质结构和关于1150-lOOOcnT1之间的 区域中与AD相关的氧化应激的信息。
[0087] 在本发明的范围内，全面认知恶化量表（在本文中也被称为⑶S)涉及Reisberg 规定的详细描述阿尔茨海默氏症进展阶段的全面衰退量表。所述量表由七个水平组成，并 且在本发明的范围内其被定义为：
[0088] -GDS-1 :相应于无认知下降的正常个体和正常临床阶段；
[0089] -GDS-2 :相应于具有极轻度认知下降水平（主观认知恶化）的个体和健忘临床阶 段；
[0090] -GDS-3 :相应于具有轻度认知下降水平的个体和早期混乱临床阶段；
[0091] -GDS-4 :相应于具有中度认知下降水平的个体和晚期混乱临床阶段；
[0092] -GDS-5 :相应于具有中等重度认知下降水平的个体和早期痴呆临床阶段；
[0093] -GDS-6 :相应于具有重度认知下降水平的个体和轻度痴呆临床阶段；
[0094] -GDS-7 :相应于具有极重度认知下降水平的个体和重度痴呆临床阶段。
[0095] 基于这种规定，⑶S-3阶段被认为是轻度阿尔茨海默氏症（轻度AD)发展水平， ⑶S-4和⑶S-5阶段被认为是中度阿尔茨海默氏症（中度AD)发展水平，并且⑶S-6和GDS-7阶段被认为是晚期的、严重的或重度的阿尔茨海默氏症（重度AD)发展水平。
[0096] 本发明的第一方面涉及通过振动光谱法确定血液样品中与阿尔茨海默氏症的全 面认知恶化相关的蛋白质结构的方法（本发明的第一方法），包括下列步骤：
[0097]a)记录事先获得的人血液样品的拉曼光谱；
[0098] b)获得下列拉曼光谱区域中至少一个的拉曼光谱值：
[0099] R.1. 1600和1700CHT1之间包括的区域；
[0100] R. 2.910和980CHT1之间包括的区域；
[0101] R. 3. 730和760CHT1之间包括的区域；
[0102] R. 4. 390和450CHT1之间包括的区域；
[0103] 其中所述光谱值选自带间拉曼强度比值、所述光谱区域面积值和/或频率值；