检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种畜牧业使用的家畜疾病检测用试纸条及制备方法，特别是一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的胶体金试纸条，和该试纸条的制备方法。
【背景技术】
[0002]山羊支原体山羊肺炎亚种是引起山羊传染性胸膜肺炎的主要病原，山羊传染性胸膜肺炎给山羊的养殖业带来了很大危害，由于该病原极易与丝状支原体山羊肺炎亚种发生混合感染，而且山羊支原体山羊肺炎亚种很难分离，故而早期的血清学诊断就成了非常重要的途径。进几年针对该病原建立了几种方法，包括血清学检测方法间接血凝和病原学检测方法PCR，其中间接血凝需要专业的技术人员操作检测，试验条件要求相对严格；而病原学检测方法PCR需要得到病羊的病变生物标本，相对较困难，而且对试验条件要求更为严格。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种可克服现有技术不足，能简捷、方便且快速地进行山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测的试纸条及其制备方法。
[0004]本发明所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条，包括:底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，其中:胶体金垫包被的抗原为经超声波破碎处理后得到的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，检测线包被的是山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，质控线为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG。
[0005]进一步，本发明所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条的胶体金垫包被的抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种M1601菌株经超声波破碎处理后得到全菌抗原。
[0006]本发明所述的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条制备方法是:
a.在胶体金中加入山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，得到金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原；
b.在不透水材料的底板上依次固定吸水材料制成的样品垫、玻璃纤维材料构成的连接垫、硝酸纤维膜和固定吸水材料制成的样品垫，并确保:样品垫与连接垫间、连接垫与硝酸纤维膜间和硝酸纤维素膜和吸收垫间相互重叠；
c.将金标山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原喷涂于连接垫上，形成金标垫，在硝酸纤维膜上以横向线状分别喷涂山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原和山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG，形成检测线和质控线，其中检测线与质控线间以间隙相隔，再用含BSA的PBS封闭硝酸纤维膜；
e.经洗脱，干燥处理后按需裁剪成适当宽度，得到试纸条。
[0007]本发明所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原制备方法是:取种子接种于MTB培养基，中，置37°C培养2?5日，将培养物离心处理后弃上清，将沉淀用用磷酸缓冲液清洗超声破碎处理后离心处理，取上清得到所需的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原，其中所用的MTB培养基制备方法如下:
培养基成分
不含结晶紫的P PLO肉汤21 g/L
25%鲜酵母浸液100mL/L
灭活马血清200mL/L
5%醋酸铊溶液4mL/L
青霉素20万IU/L
葡萄糖2 g/L
0.4% 酚红0.18mL
丙酮酸钠2 g/L
将21 g PPLO肉汤溶于700 ml无离子水中，121°C高压灭菌20分钟，其余成分混合溶解后用0.22 ym滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO肉汤中，用灭菌的IM NaOH调pH至7.6-7.8，分装试管或三角瓶等，2~8°C保存备用。
[0008]本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种的试纸条制备方法中，抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中加入20% BSA 50ul/ml、l%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后的重悬液其配方为:0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20，重悬后铺金，37°C干燥I小时，然后再进行试纸条的组装。
[0009]本发明所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备方法是:取山羊支原体山羊肺炎亚种种子接种于MTB培养基中，置37°C培养2?5日，将培养物离心处理后取上清，用冰醋酸调节培养物上清pH为5.0，煮沸I小时，冷却后用Whatman滤纸过滤，除去杂质，收集滤液，用酚-醇法提取多糖抗原后纯化处理，得到目标抗原。
[0010]本发明所述的方法中涉及的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG制备方法是:在1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株浓缩全菌液3mL中加入弗氏完全佐剂3mL，经充分混合乳化；在1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株浓缩全菌液3mL中加入弗氏不完全佐剂3mL，经充分混合乳化；选用健康雄性家兔在兔两后腿足部皮下，胭淋巴结处及背部皮下多点接种弗氏完全佐剂抗原，接种总量为1.5mL ;14日后仍以弗氏完全佐剂抗原1.5ml由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔14日后，以弗氏不完全佐剂抗原，在每只兔脚掌两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，免疫兔血清IHA效价达1:512，正式采血，采用37°C温箱放置I小时，4°C冰箱放置2小时，自然析出后3000rpm离心5min分离血清，再用饱和硫酸铵沉淀法将分离到的血清纯化获得山羊支原体山羊肺炎亚种多抗IgG。
[0011]胶体金试纸条是是一种检测时间短、方法简单易操作、且灵敏度高，且对试验条件无严格要求的检测系统。本发明的胶体金抗体检测试纸条采用的是双抗原夹心法，利用山羊支原体山羊肺炎亚种特有的多糖抗原以及全菌超破抗原两种抗原以及针对多抗提纯IgG建立检测方法，便于快速对是否感染山羊支原体山羊肺炎亚种做出判断，做到早防早治，也同时也可以对免疫后早期出现抗体进行检测。
[0012]本发明有如下优点:
(I)本发明中包被胶体金的抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种全菌超破抗原，该抗原包括了该支原体的全部特异性表位，能真实地检测山羊支原体山羊肺炎亚种产生的抗体；
(2)本发明中的检测线为山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原，该多糖抗原为山羊支原体山羊肺炎亚种所特有的抗原，经间接血凝检测不与其它任何相似支原体发生交叉反应，从而更增加了该试纸条的特异性；
(3)成本低，操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在15min内完成，比间接血凝试验以及ELISA试验节约成本，测试结果呈现肉眼可见的颜色反应，无需特殊仪器，无需特定的操作人员，可方便用于山羊支原体山羊肺炎亚种流行病学调查以及在基层推广使用；
(4)标记物稳定，标记样品在4°C贮存两年以上，无信号衰减现象；
(5)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了ELISA检测方法中酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
【附图说明】
[0013]图1:为本发明的试纸条示意图，图中:1样品吸收垫，2胶体金垫，3检测线T，4质控线C，5吸水垫，6底板，7硝酸纤维膜。
[0014]图2:为本发明的试纸条对标准阳性血清和阴性血清检测结果图，在实际的使用中:阳性显示检测线和质控线均为红色，阴性检测线不显色，质控线为红色。
[0015]图3:本发明试纸条检测的特异性检测结果图。本试纸条对绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种阳性血清进行检测，结果均为阴性，特异性良好。
[0016]图4:本发明试纸条敏感性检测结果图。山羊支原体山羊肺炎亚种阳性血清，稀释至1:1024仍能检测到为阳性，表明敏感性好。
【具体实施方式】
[0017]本发明以下结合实施例解说。
[0018]本发明的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测试纸条制备方法是:
一、山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原制备
多抗抗原制备方法如下:(I)全菌抗原的制备:取山羊支原体山羊肺炎亚种Μ1601株种子按培养基总量的5%，接种MTB培养基中，置37°C培养2?5日。将培养物12000r/min离心30min。弃上清，将沉淀用0.15M pH7.2的PBS洗2次，超声破碎3次，5000r/min离心20min，取上清得到所需的山羊支原体山羊肺炎亚种全菌抗原。测定浓度，备用；
其中所用的MTB培养基制备方法如下:
成分
不含结晶紫的P PLO肉汤21 g/L
25%鲜酵母浸液100mL/L
灭活马血清200mL/L
5%醋酸铊溶液4mL/L
青霉素20万IU/L
葡萄糖2 g/L
0.4% 酚红0.18mL丙酮酸钠2 g/L
将21 g PPLO肉汤溶于700 ml无离子水中，121°C高压灭菌20分钟，其余成分混合溶解后用0.22 ym滤膜过滤，无菌加入冷却的PPLO肉汤中，用灭菌的IM NaOH调pH至7.6-7.8，分装试管或三角瓶等，2~8°C保存备用。
[0019]二、山羊支原体山羊肺炎亚种多糖抗原制备
取取山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株种子按培养基总量的5%，接种MTB培养基中，置37°C培养2?5日。将培养物12000r/min离心30min，取上清，用冰醋酸调节培养物上清pH为5.0，煮沸I小时，等冷却后用Whatman滤纸过滤，除去杂质，收集滤液。用酸-醇法提取多糖抗原，并进行纯化处理，得到目标抗原。测定多糖浓度，备用。
[0020]三、山羊支原体山羊肺炎亚种全菌的多抗IgG制备
菌种用山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株。用弗氏完全佐剂3mL加1.2mg/ml山羊和支原体山羊肺炎亚种浓缩全菌液，3mL制备出弗氏完全佐剂抗原，并充分混合乳化；用弗氏不完全佐剂3mL加1.2mg/ml山羊支原体山羊肺炎亚种浓缩全菌液3mL制备出弗氏不完全佐剂抗原，并充分混合乳化；选用2kg左右、12月龄的健康雄性家兔。在兔两后腿足部皮下，胭淋巴结处及背部皮下多点接种弗氏完全佐剂抗原，接种总量为1.5mL ;14日后仍以弗氏完全佐剂抗原1.