一种基于表面增强拉曼散射的微流控检测芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射的微流控检测芯片。
【背景技术】
[0002] -束单色光在入射到不均匀的介质时会被介质分子散射，如入射光的频率、光子 能量大小和光子方向均发生改变时，我们称该非弹性散射为拉曼散射。拉曼散射光谱可被 用于表征分子的振动能级，在化学、物理学、生物医学等领域均有着重要的应用。在采用拉 曼散射光谱进行检测时对待检样品状态无特殊要求，液相、固相、气相样品均可测定，且具 有非接触、对样品无破坏性的优点，因此在生物样品分析、医学检测、环境监测等方面有着 巨大的应用潜力。
[0003] 然而，在激光光源问世前，由于拉曼散射光谱分析的灵敏度太低，一度阻碍 了这种分析手段的应用。自1974年弗莱希曼（Fleischman M, et al, Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 163-166)等研究人员首次在粗糙的银电极表面观察到吡啶分子的增强拉曼 散射信号以来，这种新的表面光化学效应-表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman SCattering，SERS)为拉曼散射光谱在分析领域，特别是在超灵敏生物医学检测中的应用起 到了重要的推动作用。表面增强拉曼散射是指在以粗糙的贵金属（如金、银、铜等）或其纳 米溶胶为基底表面对待检物分子进行分析时能得到显著增强的拉曼散射光谱信号。表面增 强拉曼散射的增强数量级极高，本实验室以细菌为模板合成的中空多孔银微球作为基底对 巯基吡啶进行检测，最低检测限可达l〇_ 15M，增强因子达到1011 (Dapeng Yang，et al，Green Chem. 2010, 12, 2038-2042)。
[0004] 免疫层析检测技术是上世纪80年代发展起来的一种生物分析手段，以胶体金、胶 体硒、着色乳胶微球等标记抗体或抗原后为示踪探针，当液态待检样本在毛细作用驱动下 依次通过样品垫、示踪探针垫、固化有靶配体的硝酸纤维素膜、吸水垫时在硝酸纤维素膜上 捕获并呈色相应的靶分子。该技术具有制备成本极低、操作简单(只有加样一个操作步骤)、 检测通量灵活和快速（15分钟内得到结果)的优点，因而在生物医学检测领域得到了广泛的 应用。但是，由于上述常见的标记材料和基于硝酸纤维素膜检测方案固有的限制，该技术检 测灵敏度较低，且无法进行靶分子的精确定量分析。
[0005] 截至目前，已有多种不同的基于表面增强拉曼散射光谱分析的微流控芯片方案用 于分析领域，如专利申请号为201110131032. 1的专利《微流控表面增强拉曼散射检测器件 及其制备方法与应用》，采用基于纳米凹孔表面粗糙化活性基底所制备的微流控芯片；专利 申请号为201010117672. 2的专利《一种基于表面增强拉曼散射活性基底的微流控检测器 件》，采用在衬底上制备纳米柱或纳米纤维直立结构并溅射金属纳米颗粒层得到表面增强 拉曼散射活性基底来构建微流控检测器件；又如专利申请号为201110040128. 7的专利《一 种阵列型微流控表面增强拉曼散射专用检测芯片的分析系统》，采用多点阵活性反应区固 化不同的肿瘤标志物，利用各种肿瘤标志物的拉曼指纹图谱库来进行多标志物的无标记肿 瘤标志物分析；再如申请号为200610008767. 4的专利《具有表面增强拉曼散射光谱活性基 底的微流控芯片及制备方法》，采用物理蒸发、溅射或化学沉积的方法结合掩膜技术制备币 族金属薄膜层来制备具有表面增强拉曼散射光谱活性基底的微流控芯片等等。采用外源性 驱动力来驱动待检样品的进样，该类专利的设计方案必须在配套的检测仪中设置样品驱动 模块，使得检测仪的设计复杂化，同时也提高了检测仪的制备成本。从实际应用的角度出 发，功能模块的增加也会增加设备的重量，降低设备的便携性。此外，高深宽比的垂直孔状 结构或长径比的垂直柱形结构在加工制备过程中也不利于溅射或沉积金属层，增加了制备 加工的复杂度。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼散射的微流控检测芯片。
[0007] 本发明提供的一种微流控检测芯片，是基于表面增强拉曼散射的原理制成的，该 微流控检测芯片由可产生毛细驱动力的材料、活性基底、结合物垫和样品垫按照所述顺序 依次搭接固定在载体上而成；
[0008] 所述载体可为任何用于试纸条制备或芯片制备的载体，具体可如塑料壳体；
[0009] 所述结合物垫为固化有外源性拉曼探针的聚酯薄膜或玻纤膜；
[0010] 所述固化的方式为非化学键结合；
[0011] 所述外源性拉曼探针为能与待检物质相互作用的配体和具有拉曼活性的外源性 分子共同包覆的贵金属纳米粒子构成的祀向性探针；
[0012] 所述靶向性是指特异性针对待检物质；
[0013] 所述活性基底为在表面增强拉曼散射分析时所用基底的表面上设置测试区和质 控区而得到的；
[0014] 所述测试区上连接有所述能与待检物质相互作用的配体，质控区上连接有不能与 待检物质相互作用、但能与所述待检物质相互作用的配体结合的物质；
[0015] 所述测试区在所述结合物垫一侧，质控区在所述可产生毛细驱动力的材料一侧；
[0016] 所述活性基底的测试区上能与待检物质相互作用的配体可以与待检物质结合，待 检物质又与所述外源性拉曼探针上的能与待检物质相互作用的配体结合，通过双抗体夹心 法将外源性拉曼探针固定在检测区上，通过检测外源性拉曼探针上的外源性分子的特征性 拉曼散射峰强度反应待检物质的含量；
[0017] 所述活性基底的质控区上的不能与待检物质相互作用、但能与待检物质相互作用 的配体结合的物质可以与外源性拉曼探针上的能与待检物质相互作用的配体结合，不需要 通过待检物质就可以将外源性拉曼探针固定在质控区，通过检测外源性拉曼探针上的外源 性分子的特征性拉曼散射峰强度对微流控芯片进行质控。
[0018] 上述芯片中，所述可产生毛细驱动力的材料为滤纸、玻纤膜或高分子吸水材料；
[0019] 所述样品垫为玻纤膜；
[0020] 所述贵金属纳米粒子为纳米金粒子或纳米金棒；
[0021] 所述能与待检物质相互作用的配体通过包括金硫键在内的作用与纳米金粒子连 接；
[0022] 所述外源性分子通过包括金硫键在内的作用与纳米金粒子连接；
[0023] 所述在表面增强拉曼散射分析时所用基底为表面覆有贵金属薄层的具有向上突 出的尖锥状结构阵列的聚合物厚膜或板；
[0024] 所述聚合物为能在一定条件下固化成型的聚合物；
[0025] 所述尖锥的锥洞顶部为任意封闭性几何图形。
[0026] 所述封闭性几何图形具体为三角形，梯形，椭圆形或圆形；
[0027] 所述尖锥状结构阵列为微尖锥结构阵列；
[0028] 所述微尖锥结构阵列中的锥体高度为20-500微米，锥底面积为225-250000平方 微米；
[0029] 所述贵金属薄层的厚度为30_300nm;
[0030] 所述聚合物厚膜或板的厚度为100-3000um;
[0031] 所述能在一定条件下固化成型的聚合物为聚酰亚胺或聚二甲基硅氧烷；
[0032] 所述能与待检物质相互作用的配体为抗体或抗原。
[0033] 上述任一所述的芯片中，所述具有拉曼活性的外源性分子为5, 5'二硫代双（2-硝 基苯甲酸）；
[0034] 所述待检物质为蓖麻毒素；
[0035]所述抗体为抗蓖麻毒素多克隆抗体；
[0036] 所述不能与待检物质相互作用、但能与待检物质相互作用的配体结合的物质为羊 抗兔多克隆抗体；
[0037] 所述表面覆有贵金属薄层的具有向上突出的尖锥状结构阵列聚合物厚膜或板是 先经过巯基羧基双功能化的聚乙二醇功能化的聚合物厚膜或板；
[0038] 所述巯基羧基双功能化的聚乙二醇通过金硫键连接在所述表面覆有贵金属薄层 的具有向上突出的尖锥状结构阵列聚合物厚膜或板上；
[0039] 所述抗蓖麻毒素多克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体通过酰胺键连接在巯基羧基双 功能化的聚乙二醇上，进而固定在所述表面覆有贵金属薄层的具有向上突出的尖锥状结构 阵列聚合物厚膜或板上；
[0040] 所述聚合物为聚二甲基硅氧烷；
[0041] 所述聚合物厚膜或板的厚度为5000 i! m;
[0042] 所述贵金属为金；
[0043] 所述贵金属薄层的厚度为200nm;
[0044] 所述封闭性几何图形为圆形；
[0045] 所述图形直径为50 iim，圆形和圆形之间的距离为30μm。
[0046] 所述结合物垫长为3mm，宽为2mm;
[0047] 所述样品垫长为3mm，宽为2mm;
[0048] 所述高分子吸水材料长为5,宽为2mm;
[0049] 所述活性基底长为4mm，宽为2mm。
[0050] 上述任一所述的芯片中，所述外源性拉曼探针的制备方法如下：将所述能与待检 物质相互作用的配体加入所述贵金属纳米粒子溶液中，温育，离心弃上清得沉淀；用含有 BSA的pH7. 4的0. 1M的PBS重悬沉淀物，加入所述具有拉曼活性的外源性分子，反应，离心 得沉淀；将其重悬于含有BSA、PEG20000、Na 3N、蔗糖、海藻糖和Tween-20的10mM pH7. 4的 PBS缓冲液中，得到所述外源性拉曼探针溶液；
[0051] 所述结合物垫按照如下方法制备：将所述聚酯薄膜或玻纤膜浸入所述外源性拉曼 探针溶液中，干燥过夜即得；
[0052] 所述BSA的作用是封闭能与待检物质相互作用的配体和外源性分子包覆贵金属 纳米粒子后的剩余活性位点；
[0053] 所述活性基底按照如下方法制备：用Piranha溶液浸泡所述在表面增强拉曼散射 分析时所用基底，洗净，再将其浸入巯基羧基双功能化的聚乙二醇水溶液中反应，得到功能 化后的基底；用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）_碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺将能与 待检物质相互作用的配体偶联在功能化的基底上制成测试区，同样将不能与待检物质