SeCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于Ag2SelgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备方法与应用。具体是以&02-1102复合纳米材料作为光活性基底材料，以Ag 2SeiCdSe为抗体标记物，通过标记物Ag2SeOCdSe对基底材料的信号放大作用，制备一种检测心肌肌钙蛋白T夹心型光电化学传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
【背景技术】
[0002]光致电化学检测一种新兴的生物分析检测方法。在光致电化学检测过程中，光为激发信号，电信号作为检测信号，由于激发信号与检测信号的完全分离导致背景信号的降低，使光致电化学具有比传统的电化学方法更高的灵敏度。因此，将免疫分析技术与光电检测技术结合，能够大大提高被测物检测的灵敏度，实现待测物的高灵敏检测。此外，与荧光、化学发光等光学检测方法对比，光致电化学检测具有简单和成本低等优点。近几年来，光电化学传感器已广泛应用于疾病分析、环境治理与食品检测中。急性心肌梗死是急性冠脉综合征的严重类型，起病急骤，病情进展迅速，病死率高。传统的心肌酶学检查存在着灵敏度低，升高持续时间短等缺点。因此，针对心肌损伤特异性标志物心肌肌钙蛋白T的快速、高灵敏检测对急性心肌梗死早期准确诊断、及时正确治疗，改善预后及降低病死率等具有重要意义。
[0003]1102是一种在光催化、太阳能电池以及燃料电池等方面应用广泛的半导体材料，然而由于T12宽的禁带宽度(3.2 eV)，只能在紫外光区被有效激发，因此在可见光区的光电转换效率极低，且打02纳米带具有较高的电子空穴复合效率，这给其应用带来一定的困难。&02纳米颗粒具有较窄的禁带宽度(2.7 eV)，将其与纳米带状的T12复合，可有效降低纳米带状的T12电子空穴复合效率且增强其在可见光的吸收。Ag2Se@CdSe材料具有窄的禁带宽度和优异的光电化学性能，可进一步增强基底材料的光电活性。本发明以CeO2-T12复合纳米材料作为光活性基底材料，以Ag2SeOCdSe为抗体标记物，通过标记物Ag2SeOCdSe对基底材料的信号放大作用，制备一种检测心肌肌钙蛋白T夹心型光电化学传感器，可实现肌钙蛋白T的高灵敏检测，该传感器具有操作简单、成本低、高灵敏及选择性好的优点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是一种基于Ag2SeOCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备。
[0005]本发明的目的之二是将该光电化学免疫传感器应用于心肌损伤特异性标志物心肌肌钙蛋白T高灵敏检测。
[0006]本发明的技术方案
1.一种基于Ag2SeIgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备方法
(I)ITO电极的预处理:将ITO导电玻璃切割至2 cm X 0.5 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min，用氮气吹干；
(2)滴加6μ?、4~6 mg/mL CeO2-T12S液于电极表面，室温条件下晾干；
(3)滴加6μ?、8~12 Pg/mL的心肌肌钙蛋白T捕获抗体Ab1于电极表面，4°C冰箱中晾干，超纯水冲洗；
(4)滴加3PL、质量分数为0.5 ~ 2.0%的BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4 0C冰箱中晾干；
(5)用超纯水清洗，晾至湿润状态，将6ixU0.001 ng/mL ~ 20 ng/mL不同浓度的心肌肌钙蛋白T抗原溶液滴涂于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗以除去未结合的心肌肌钙蛋白T抗原，室温下晾干；
(6)用超纯水清洗，晾至湿润状态，继续滴加6μ L标记抗体孵化物Ag2SelgCdSe-Ab2S液于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种基于Ag2SelgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器。
[0007]2.CeO2-T12的制备
(1)T12纳米带的制备:将0.05~0.15 g T12粉末加入到 10~30 mL、10 mol/L NaOH溶液中，于聚四氟乙烯反应釜中200°C条件下反应24 h，所得产物用0.1 mol/L的盐酸与超纯水离心洗涤数次至溶液的PH为7，50 °C真空干燥箱中干燥，于马弗炉中700 0C条件下煅烧30min,制得T12纳米带；
(2)Ce02-Ti02的制备:将0.2~0.4 mmol 的 Ce (NO3)3.2H20 与 1-2 mmol 的 T12纳米带溶解于100 mL超纯水中，剧烈搅拌30 min，用氨水调节溶液的pH为10，混合溶液在100°C条件下反应48 h，所得产物分别用超纯水、乙醇离心洗涤，50°C真空干燥箱中干燥，产物于马弗炉中550°C条件下煅烧2 h，制得Ce02-Ti02。
[0008]3.标记抗体孵化物Ag2SeOCdSe-Ab2溶液的制备
(1)Ag2SeiCdSe溶液的制备:将 0.05-0.06 g CdCl2.2.5Η20、0.01-0.02 g SeO2^P0.1-0.3 g聚乙烯吡咯烷酮k-30溶解于10 mL N，N-二甲基甲酰胺中，持续搅拌条件下向溶液中加入3~7 mL巯基乙酸和0.1-0.3 mL、4 mmol/L AgNO3溶液，将所得溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中140°C条件下反应6 h，将所得产物用异丙醇离心洗涤三次，重新分散在2mL、pH=7.4 PBS缓冲液中，制得Ag2SeiCdSe溶液；
(2)标记抗体孵化物Ag2SeOCdSe-Ab2溶液的制备:向所制得Ag2SeiCdSe溶液中加入ImL 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC/N-羟基琥珀酰亚胺NHS交联剂和ImL、8 ~ 12 μ g/mL的心肌肌妈蛋白T标记抗体Ab2，于4 CtiL温震汤器中震汤12 h，用超纯水离心洗涤去掉未结合的Ab2分子，重新分散在I mL、pH=7.4 PBS缓冲液中，制得标记抗体孵化物Ag2SeOCdSe-Ab2溶液。
[0009]4.心肌肌钙蛋白T的检测方法
(1)采用三电极体系进行测定，如权利要求1所制备的光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，利用光电化学工作站进行检测，光电检测采用1-t测试手段，偏压设置为0.1 V，光源为405 nm，每隔10 s进行开关灯；
(2)在15mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗坏血酸的PBS缓冲溶液中，通过光电化学工作站检测0.001 ng/mL ~ 20 ng/mL—系列不同浓度的心肌肌1?蛋白T标准溶液，通过记录开关灯前后产生的不同光电流信号，绘制工作曲线； (3)将待测样品溶液代替心肌肌钙蛋白T标准溶液进行检测，检测的结果可通过工作曲线的查得。
[0010]本发明的有益成果
(I)本发明以CeO2-T12复合纳米材料为光电活性基底材料，拥有较单独T1 2纳米材料优异的光电转换特性。
[0011 ] (2)本发明以Ag2SeOCMSe为标记物，可明显提尚基底材料的光电?目号响应，增加了该光电化学传感器的灵敏度。
[0012](3)本发明基于Ag2SelgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器心肌损伤特异性标志物心肌肌钙蛋白T高灵敏检测，操作简单，实现高灵敏检测，所测得线性范围为 0.001 ng/mL~20 ng/mL，检测限为 0.33 pg/mL。
【具体实施方式】
[0013]实施例1一种基于Ag2SelgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备方法:
(I) ITO电极的预处理:将ITO导电玻璃切割至2 cm X 0.5 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min,用氮气吹干。
[0014](2)滴加6 μ?、4 mg/mL CeO2-T12S液于电极表面，室温条件下晾干。
[0015](3)滴加6 μ?、8 Pg/mL的心肌肌钙蛋白T捕获抗体Ab1于电极表面，4°C冰箱中晾干，超纯水冲洗；
(4)滴加3PL、质量分数为0.5 %的BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4°C冰箱中晾干；
(5)用超纯水清洗，晾至湿润状态，将6ixU0.001 ng/mL ~ 20 ng/mL不同浓度的心肌肌钙蛋白T抗原溶液滴涂于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗以除去未结合的心肌肌钙蛋白T抗原，室温下晾干。
[0016](6)用超纯水清洗，晾至湿润状态，继续滴加6 μ L标记抗体孵化物Ag2SeOCdSe-Ab2溶液于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种基于Ag2SeiCdSe标记的夹心型心肌肌妈蛋白T的光电化学传感器。
[0017]实施例2 —种基于Ag2SelgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备方法:
(I)ITO电极的预处理:将ITO导电玻璃切割至2 cm X 0.5 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min,用氮气吹干。
[0018](2)滴加6 μ?、5 mg/mL CeO2-T12S液于电极表面，室温条件下晾干。
[0019](3)滴加6 μ?、10 Pg/mL的心肌肌钙蛋白T捕获抗体Ab1于电极表面，4°C冰箱中晾干，超纯水冲洗；
(4)滴加3μ?、质量分数为I %的BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4°C冰箱中晾干；
(5)用超纯水清洗，晾至湿润状态，将6ixU0.001 ng/mL ~ 20 ng/mL不同浓度的心肌肌钙蛋白T抗原溶液滴涂于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗以除去未结合的心肌肌钙蛋白T抗原，室温下晾干。
[0020](6)用超纯水清洗，晾至湿润状态，继续滴加6 μ L标记抗体孵化物Ag2SeOCdSe-Ab2溶液于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种基于Ag2SeiCdSe标记的夹心型心肌肌妈蛋白T的光电化学传感器。
[0021]实施例3 —种基于Ag2SelgCdSe标记的夹心型心肌肌钙蛋白T的光电化学传感器的制备方法:
(I) ITO电极的预处理:将ITO导电玻璃切割至2 cm X 0.5 cm大小，依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗30 min,用氮气吹干。
[0022](2)滴加6 PL、6 mg/mL CeO2-T12S液于电极表面，室温条件下瞭干。
[0023](3)滴加6 μ?、12 Pg/mL的心肌肌钙蛋白T捕获抗体Ab1于电极表面，4°C冰箱中晾干，超纯水冲洗；
(4)滴加3PL、质量分数为2.0%的BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，4°C冰箱中晾干；
(5)用超纯水清洗，晾至湿润状态，将6ixU0.001 ng/mL ~ 20 ng/mL不同浓度的心肌肌钙蛋白T抗原溶液滴涂于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗以除去未结合的心肌肌钙蛋白T抗原，室温下晾干。
[0024](6)用超纯水清洗，晾至湿润状态，继续滴加6 μ L标记抗体孵化物Ag2SeOCdSe-Ab2溶液于电极表面，4°C冰箱中孵化I h，用超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种基于Ag2SeiCdSe标记的夹心型心肌肌妈蛋白T的光电化学传感器。
[0025]实施例4 CeO2-T12的制备方法:
(I) T12纳米带的制备:将0.05 g T12粉末加入到10 mL、10 mol/L NaOH溶液中，于聚四氟乙烯反应釜中200°C条件下反应24 h，所得产物用0.1 mol/L的盐酸与超纯水离心洗涤数次至溶液的pH为7，50°C真空干燥箱中干燥，于马弗炉中700°C条件下煅烧30 min,制得1102纳米带。
[0026](2) CeO2-T12的制备: