一种测定人血浆中丹参素,间位甲基丹参素,原儿茶醛及原儿茶酸的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种药物含量的测定方法，特别涉及一种测定人血浆中丹参素，间位 甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。
【背景技术】：
[0002] 复方丹参滴丸为天士力公司开发的活血化瘀、理气止痛中药，用于胸中憋闷、心绞 痛，其主要成分为丹参、三七、冰片，其药理作用包括1增加冠脉血流量，2增加心肌耐缺氧 保护缺血心肌,3抗血小板聚集防止血栓形成，4改善微循环。
[0003] 复方丹参滴丸中丹参味苦，性微寒，具有活血化瘀，养血安神，凉血排痈和排毒生 肌的功效，是中药活血化瘀的常用药物。丹参药材主含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚 酸类成分，尚含有黄酮类、三萜类、留醇等其他成分。二萜类成分中属醌、酮型结构的有丹参 酮I、IIA、IIK、V、VI，隐丹参酮，异丹参酮I、II、IIB，二氢丹参酮I等。水溶性的酚酸类成 分有丹参素，原儿茶醛，咖啡酸及丹参素与咖啡酸的衍生物或二聚物酯化而成的缩酚酸。
[0004] 丹参素、原儿茶醛是复方丹参滴丸的主要成分，近年来，有关生物样品中丹参素、 原儿茶醛、原儿茶酸的含量测定方法（如HPLC、LC-MS/MS等）有较多报道，但大多为上述化 合物单独测定的方法。据文献报道，丹参素、原儿茶醛在人体会分别代谢生成间位丹参素和 原儿茶酸。
[0005] 中药药物代谢动力学是应用动力学原理，研究中药活性成分、组分、单味药和复方 体内吸收、分布、代谢、排泄和毒性的动态变化规律及其体内时-量、时-效关系，并用数学 函数加以定量描述的一门新兴学科。开展中药药物代谢动力学研究对阐明和揭示中药药 效物质基础和作用机制，设计及优选中药给药方案，促进中药新药研发、剂型改进及质量控 制，均具有重要意义。目前中药药动学研究方法归纳起来可分为两大类，一类是针对成分明 确的中药及复方，即血药浓度法；另一类是化学基础研究薄弱成分尚不明确的中药及复方， 该类主要以生物效应法为研究手段，包括药理效应法、药物累积法、效量半衰期法、微生物 法等。液相色谱质谱法是最近十几年来发展起来的一种新的分离分析方法，由于其高选择 性和高灵敏度已成为药代动力学研究的一种较理想的检测方法。
[0006] 为深入研究复方丹参滴丸主要成分在人体内的吸收及代谢过程，需要建立一种丹 参素、原儿茶醛及其代谢产物同时测定的方法。
[0007] 本发明经过研究找到一种丹参素、原儿茶醛、间位丹参素和原儿茶酸人血浆中联 测的LC-MS/MS方法，本方法具有专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好等优点，满足人体 药代动力学要求。
【发明内容】
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[0008] 人在服用含有丹参的药物，如复方丹参滴丸后，经过吸收和代谢，血浆中含有丹参 素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸。为检测服用复方丹参滴丸后人体血浆中上述成 分的含量本发明提供了一种测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸 的方法，所述方法，包括以下步骤：
[0009] 1)对照品储备液的制备
[0010] 称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，用甲醇溶解，即得丹 参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品储备液。
[0011] 2)内标溶液的制备
[0012] 取内标物香草酸用甲醇溶解即得内标溶液。
[0013] 3)血浆样品处理方法
[0014] 取血浆样品，加入内标溶液，甲醇，盐酸，乙酸乙酯，混合均匀后，离心取上清乙酸 乙酯层，干燥，用甲醇复溶，离心，得血浆样品上清液。
[0015] 4)含量测定
[0016] 采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液和血浆样品上清液注入色谱仪，得到 色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在 血浆中的浓度。
[0017] 优选的，所述方法，包括以下步骤：
[0018] 1)对照品储备液的制备
[0019] 分别称取丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品，分别用甲醇配成 浓度为150-250i!g/ml的对照品储备液I。
[0020] 分别取4种对照品储备液I，分别用40-60% (V/V)甲醇水溶液配制浓度均为 2-6yg/ml的各自的对照品储备液II。
[0021] 2)内标溶液的制备
[0022] 称取内标物香草酸用甲醇配制成150-250yg/ml的内标储备液，进一步用甲醇配 制成3-7iig/ml的香草酸内标溶液。
[0023] 3)血浆样品处理方法
[0024] 取血浆样品150-250iil，依次加入内标溶液30-70iil，40-60% (V/V)甲醇水溶液 30-70yl，0. 5-2mol/L的盐酸溶液10-30yl，涡旋均匀，加入0. 5-2ml乙酸乙酯，涡旋振荡 20-40s，离心，取上清乙酸乙酯层500-1200iil，用氮气流吹干，用100-150iil40-60% (V/V) 甲醇水溶液复溶，离心，得血浆样品上清液。
[0025] 4)含量测定
[0026] 采用LC-MS/MS色谱法，将上述各自的对照品储备液II和血浆样品上清液注入色 谱仪，得到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和 原儿茶酸在血浆中的浓度。
[0027] 最优选的，所述方法，包括以下步骤：
[0028] 1)对照品储备液的制备
[0029] 分别精密称取丹参素对照品、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸对照品各 10.Omg分别置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得丹参素、间位甲基丹参 素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为200g/ml的对照品储备液I。
[0030]精密量取200ill各自对照品储备液I，分别用50%甲醇水溶液定容至10ml，即得 丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸浓度均为4yg/ml的各自的对照品储备液 II。
[0031] 2)内标溶液的制备
[0032] 精密量取内标物香草酸10.Omg置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇 匀，即得200yg/ml的内标储备液，精密量取此内标储备液125ill置于5ml容量瓶中，用甲 醇溶解并稀释至刻度，即得5yg/ml的内标溶液。
[0033] 3)血浆样品处理方法
[0034]取血浆样品200ill，依次加入内标溶液50ill，50%甲醇水溶液50ill，lmol/L的盐 酸溶液20iU，涡旋均匀，加入lml乙酸乙酯，涡旋振荡30s，15000rpm离心lmin，取上清乙 酸乙酯层900iil，40°C下氮气流吹干，用120iU50%甲醇水溶液复溶，15000rpm离心3min， 得血浆样品上清液。
[0035] 4)含量测定
[0036] 采用LC-MS/MS色谱法，将上述对照品储备液II和血浆样品上清液注入色谱仪，得 到色谱图，根据色谱图中色谱峰的面积计算丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸 在血浆中的浓度。
[0037] 其中所述LC-MS/MS色谱法，色谱条件如下：
[0038]色谱柱：C18 柱(优选：DikmaDiamonsilC18 柱，50X2.lmm, 5ym);预柱：菲罗门公 司预柱（型号：KJ0_4282);流动相：A相为0. 1%的甲酸水溶液和B相为含0. 1%甲酸的甲 醇，进行梯度洗脱：〇_〇? 5minl% ~4%(优选 2%) (B)，0? 5-4. 5minl% ~4% 至 75% ~95% (优 选 2% 至 85%) (B)，4. 51-5min75% ~95% 至 95% (优选 85% 至 95%) (B)，5. 01-6. 5min75% ~ 95% 至 1% ~4% (优选 95% ~2%) (B);流速：0? 2 ~0? 5ml/min(优选：0? 35ml/min);柱温： 15~35°C(优选：25°C);进样器温度：2~10°C(优选：4°C)。
[0039] 质谱条件：采用ESI离子源，负离子模式。选择多反应监测模式（MRM)进行二级 质谱分析。相关质谱参数如下〖CollisionGas:Medium;IonSprayVoltage:-3000~-5500V(优选：-4200V);Temperature:400~70(TC(优选60(TC);CurtainGas:10. 0~ 40.0(优选20.0;IonSourceGasl:40.0~80.0(优选：60.0);IonSourcGas2:35.0~ 75. 0(优选：55. 0)。
[0040] 在上述色谱条件下，丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在 3. 15min、3. 92min、3. 63min和3. 25min左右出峰，内标（香草酸）在4. 13min左右出峰，峰 形良好，说明人血浆中无杂质峰干扰上述化合物的测定，表明该方法具有较强的专属性。色 谱图详见图1。
[0041] 本发明研究了液相色谱质谱法（LC-MS/MS法)同时测定人血浆中丹参素，间位甲基 丹参素，原儿茶醛及原儿茶酸的方法。在实验确定的样品处理及一定色谱条件下，丹参素 (DSS)在 1. 38-1000ng/ml范围内的r为 0. 9978,间位甲基丹参素（m-DSS)在 0. 46-1000ng/ ml范围内的r为0. 9977,原儿茶醛（PCA)在0. 46-1000ng/ml范围内r为0. 9975,原儿茶 酸（PAA)在1. 38-1000ng/ml范围内r为0. 9948,4个化合物在各自浓度范围内具有良好 的线性关系（r>0. 994);测定丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛及原儿茶酸分别在低浓度 4. 13ng/ml、中浓度37ng/ml和高浓度333. 3ng/ml时的提取回收率、日内和日间精密度和准 确度，表明本法采用血浆样品处理方法对不同浓度的血浆样品具有较为稳定的提取效果， 日内、日间精密度结果表明方法的重现性很好（RSD均小于13. 54%，指导原则规定RSD值应 小于15%)，此外，实侧浓度与理论浓度的相对误差也小于15%，表明方法的准确度很好；对 于丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶醛及原儿茶酸的三个冻融周期稳定性，对照品储备液II 的稳定性以及拟进样样品的稳定性进行了实验，结果表明丹参素、间位甲基丹参素、原儿茶 醛和原儿茶酸在上述存放或操作条件下具有良好的稳定性（相对误差均小于15%)，从而保 证了实验数据的可靠。本实验所建立的同时测定人血浆中丹参素，间位甲基丹参素原儿茶 醛和原儿茶酸的LC-MS/MS分析方法具有专属性强、灵敏度高、准确性和重现性好等优点， 满足人体药代动力学要求，可应用于临床药代动力学研究。
[0042] 相关术语的解释：
[0043] 丹参素：化学名为[D(+)-B_(3,4二羟基苯基）乳酸]，具有抵抗血小板粘附聚集， 清除氧自由基等作用，是中药丹参（SalviamiltiorrhizaBunge)的有效成分之一。
[0044] 原儿茶醒：化学名为Benzaldehyde, 3, 4-dihydroxy-，3, 4-二羟基苯甲醒，存在于 丹参的根部，具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量作用，扩张心脑血管，抑制血小板聚集等 作用。
[0045] 原儿茶酸：别名为3, 4-二羟基苯甲酸，存在于鳞始蕨科植物