一种卷烟烟气体外免疫毒性的Luminex悬浮芯片测试方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及卷烟烟气体外免疫毒理学评价研宄领域，具体说是一种卷烟烟气体外 免疫毒性的Luminex悬浮芯片测试方法。
【背景技术】
[0002] 卷烟烟气的体外免疫毒理学研宄已经成为评价吸烟对健康危害的重要手段之一， 目前，有关卷烟烟气的体外免疫毒性的研宄大多数通过测试特定分泌的细胞因子，进而反 应免疫毒性。
[0003] 测试细胞因子的方法有三类：一、生物学测试法。该方法的优点是敏感，可以 直接测定生物学功能，如细胞增殖法、靶细胞杀伤法、抗病毒活性测定法；二、免疫学测 试法。该方法具有简单、迅速、重复性好的特征，如酶联免疫吸附试验（Enzymelinked immunosorbentassay,ELISA)、放射免疫分析（Radioimmunoassay,RIA)、蛋白质印迹 (Westernblotting);三、分子生物学方法。该方法用于检测细胞因子基因表达情况进而探 讨机制，如Northernblot、RT-PCR、实时定量PCR等。
[0004] 针对卷烟烟气体外免疫毒性，国内外大多应用ELISA法检测卷烟烟气刺激细胞 单个或几种细胞因子的分泌情况进而反应免疫毒性，但该方法，一次性测试一种细胞因子， 测试效率低下，并且所需样品量多。同时，目前所研宄的细胞因子多达几十种，要客观、准 确、实时反映在某一过程中细胞因子复杂网络变化，采用该ELISA法显然是不可能实现的。 因此，发展一种高通量的，实时测试卷烟烟气体外免疫毒性方法在当今背景下显得日益迫 切。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是针对卷烟烟气体外免疫毒性检测过程中，样品前处理繁琐费 时，所需样品量大，效率低下，不能同时检测的问题，提供一种Luminex悬浮芯片同时检测 卷烟主流烟气20种细胞因子的方法。该方法可以同时检测多种细胞因子分泌，将使卷烟烟 气体外免疫毒性的研宄提升到更全面、客观的研宄水平。其结果可实现细胞因子网状调节 的系统分析，适用于大批量样品的体外免疫毒性测试，为进一步探讨免疫毒性调节机制提 供实验依据。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种卷烟烟气体外免疫毒性的Luminex悬浮芯片测试方法，包括以下具体步骤： 1) 细胞与细胞因子选择：细胞选择为对烟气冷凝物敏感的巨噬细胞Ana-1细胞，该细 胞受到吸入性颗粒刺激后可分泌与免疫相关的多种细胞因子；细胞因子选择涵盖白细胞介 素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子6类细胞因子中与免疫相关 的有代表性的20种细胞因子作为待检测细胞因子； 2) 细胞培养：Ana-1细胞生长于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，放置于 37°C、5% 0)2的细胞培养箱中生长； 3) 样品制备：将指数生长期的Ana-1细胞，按2X104cells/孔的浓度接种于96孔板 中，培养24h后，进行卷烟烟气冷凝物（TPM)染毒，加入烟气冷凝物后使得终浓度为0yg/ mL，2. 5yg/mL，5yg/mL，10yg/mL和20yg/mL，每种条件设5个平行孔，每孔培养基总 体积为200yL，置于37°C、5%C02的细胞培养箱中培养24h，培养结束后，将培养液转移 至离心管中，1000g离心10min，收集细胞上清液，保存于-80°C冰箱中，用于细胞因子测 试； 4) 细胞因子测定：在室温条件下，将96孔液相芯片实验板平衡30min，加入200yL 洗液Washsolution(该洗液为lifetechnology公司生产的LMC0006所含试剂）至反应 孔，30s预湿，真空泵抽吸除去孔内液体，加入25yL的抗体包被磁珠Antibody-coated beads(该抗体包被磁珠为lifetechnology公司生产的LMC0006所含试剂），并加入 200yL洗液Washsolution，预湿磁珠30s后抽吸除孔内去液体；加入50yL孵育液 Incubationbuffer(该孵育液为lifetechnology公司生产的LMC0006所含试剂）及100 UL细胞上清液至反应孔，避光震荡孵育2h，真空泵抽吸除去孔内液体，加入100yL的测 试抗体Detectantibody(该测试抗体为lifetechnology公司生产的LMC0006所含试剂） 及至反应孔，避光震荡孵育1h。清洗两次后，加入100yL的链霉亲和素-RPESAV-RPE， 避光孵育30min，洗液清洗2次，真空抽吸除去孔内液体，加入100yL的洗液震荡3min， 采用Luminex悬浮芯片仪进行20种细胞因子的测试； 5) 结果与分析：测试结果通过Bio-PlexManagerTM软件包(芯片仪预装的软件包）自 动计算生成，系统软件包将20种细胞因子的标准曲线通过回归模型计算并进行优化，同时 生成各细胞因子的定量测试浓度值。
[0007] 与现有技术相比，本发明方法具有如下优良效果： 该技术可以实现20种细胞因子的同步检测，本方法具有高通量、成本低、耗量小、周期 较短等优点，可以实现细胞因子网状调节的系统分析，可以为深入探讨免疫毒性调节机制 提供实验依据。该方法适用于多种卷烟的体外免疫毒性的检测。
【附图说明】
[0008] 图1为本发明的工艺步骤图。
【具体实施方式】
[0009] 实例对某国产品牌卷烟进行评价 收集处于指数生长期的Ana-1细胞以2X104cells/孔细胞接种于96孔板中，于细胞 培养箱中培养24h后进行某国产品牌卷烟染毒。实验中分别以0yg/mL，5yg/mL，10yg/ mL，20yg/mL，30yg/mL，40yg/mL和50yg/mL的某国产品牌卷烟的剂量染毒Ana-1细 胞，每种条件设5个平行孔，每孔培养基总体积为200yL，置于37°C、5%C02的细胞培养箱 中培养24h。染毒结束后，收集培养液，1000g离心10min，收集细胞上清液。96孔液相芯片 实验板于室温条件下平衡30min，加入200yL洗液Washsolution(由lifetechnology 公司生产的LMC0006所含试剂)至反应孔，30s预湿，真空泵抽吸除去孔内液体，加入25yL 的抗体包被磁珠Antibody-coatedbeads(由lifetechnology公司生产的LMC0006所含 试剂)，并加入200yL洗液Washsolution，预湿磁珠(是指前述抗体包被的磁珠）30s后 抽吸除孔内去液体；加入50yL孵育液Incubationbuffer(由lifetechnology公司生 产的LMC0006所含试剂）及100yL细胞上清液至反应孔，避光震荡孵育2h，真空泵抽吸 除去孔内液体，加入100yL的检测抗体Detectantibody(由lifetechnology公司生 产的LMC0006所含试剂）至反应孔，避光震荡孵育1h。清洗两次后，加入100yL的链霉 亲和素-RPESAV-RPE，避光孵育30min，洗液清洗2次，真空抽吸除去孔内液体，加入100 yL的洗液震荡3min，采用Luminex液相芯片仪检测细胞因子。检测结果通过Bio-Plex ManagerTM软件包自动计算生成。系统软件包将20种细胞因子的标准曲线通过回归模型 计算并进行优化，同时生成各细胞因子的定量检测浓度值。表1显示的是某国产品牌卷烟 20种细胞因子的原始检测结果。表2显示的是20种细胞因子的检测结果（平均值和标准 差）。
【主权项】
1. 一种卷烟烟气体外免疫毒性的Luminex悬浮芯片测试方法，其特征在于：包括以下 具体步骤： 1) 细胞与细胞因子选择：细胞选择为对烟气冷凝物敏感的巨噬细胞Ana-I细胞，该细 胞受到吸入性颗粒刺激后可分泌与免疫相关的多种细胞因子；细胞因子选择涵盖白细胞介 素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子、生长因子6类细胞因子中与免疫相关 的有代表性的20种细胞因子作为待检测细胞因子； 2) 细胞培养：Ana-I细胞生长于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，放置于 37 °C、5% CO2的细胞培养箱中生长； 3) 样品制备：将指数生长期的Ana-I细胞，按2X IO4 cells/孔的浓度接种于96孔板 中，培养24 h后，进行卷烟烟气冷凝物（TPM)染毒，加入烟气冷凝物后使得终浓度为0 yg/ mL，2. 5 yg/mL，5 yg/mL，10 yg/mL和20 yg/mL，每种条件设5个平行孔，每孔培养基总 体积为200 y L，置于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，培养结束后，将培养液转移 至离心管中，1000 g离心10 min，收集细胞上清液，保存于-80°C冰箱中，用于细胞因子测 试； 4) 细胞因子测定：在室温条件下，将96孔液相芯片实验板平衡30 min，加入200 yL洗 液Wash solution至反应孔，30 s预湿，真空泵抽吸除去孔内液体，加入25 y L的抗体包被 磁珠Antibody-coated beads，并加入200 y L洗液Wash solution预湿磁珠30 s后抽吸 除孔内去液体；加入50 y L孵育液Incubation buffer及100 y L细胞上清液至反应孔， 避光震荡孵育2 h，真空泵抽吸除去孔内液体，加入100 y L的测试抗体Detect antibody 及至反应孔，避光震荡孵育I h ;清洗两次后，加入100 y L的链霉亲和素-RPE SAV-RPE，避 光孵育30 min，洗液清洗2次，真空抽吸除去孔内液体，加入100 y L的洗液震荡3 min，采 用Luminex悬浮芯片仪进行20种细胞因子的测试； 5) 结果与分析。
2. 根据权利要求1所述的卷烟烟气体外免疫毒性的Luminex悬浮芯片测试方法，其特 征在于：在步骤5)中，测试结果通过Bio-Plex Manager TM软件包自动计算生成，系统软件 包将20种细胞因子的标准曲线通过回归模型计算并进行优化，同时生成各细胞因子的定 量测试浓度值。
【专利摘要】一种卷烟烟气体外免疫毒性的Luminex悬浮芯片测试方法，特征是：包括以下步骤：1）细胞与细胞因子选择，2）细胞培养，3）样品制备，4）细胞因子测定，5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：高通量、低成本、快速且所需样品少，可以同时测试20种不同类型细胞因子的表达量，可以实现细胞因子网状调节的系统分析，从而解决了以往试验中一次仅能测试一种细胞因子及对结果片面性解释的不足。本发明的细胞前处理简便、快速，加快了细胞因子的测试速度，提高了测试效率，20种细胞因子的定量测试过程仅需4h。本方法所需样品少，用于测试的细胞上清液仅需100μL，适用于大批量样品的体外免疫毒性测试。
【IPC分类】G01N33-554
【公开号】CN104849450
【申请号】CN201510287136
【发明人】赵俊伟, 李翔, 谢复炜, 赵阁, 康彧, 尚平平, 刘惠民, 谢剑平
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月31日