一种肠出血性大肠杆菌o157:h7乳胶凝集检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌〇157:H7乳胶凝集检测试剂盒及在肠出血性 大肠杆菌0157:H7检测中的应用，属禽类免疫学技术领域。
【背景技术】
[0002] 肠出血性大肠杆菌0157:H7是一种重要的食源性病原菌，是当今世界上不断增多 的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因之一。该菌能感染禽类和其它动物，人主要 通过污染的食物发病。1982年，0157:H7首先在美国发现，此后在世界各地散发或地方流 行，已成为全球性的公共卫生和食品安全问题。因此发展快速、敏感、特异的检测方法和试 剂是确保饮水和食品安全、预防大肠杆菌〇157:H7感染发生的重要手段。目前，国内外已 报道的检测方法有多重PCR、基因芯片、噬菌体分型、脉冲场凝胶电泳分析、生物传感器等， 这些方法在检测方面各有所长，但大多对仪器设备要求较高，因此使用范围有很大的局限 性。分离培养鉴定仍是检测〇157:H7的金标准，但其通常需要数天才能得到结果，不能满足 快速诊断的要求。在大肠杆菌0157:H7的免疫学检测方法中，所用抗体多为多克隆抗体，抗 0157:H7的多克隆抗体与抗其它肠道细菌的抗体存在着严重交叉反应，通常的纯化不能满 足精确的血清学检验需求，而用单克隆抗体为基础建立的抗原检测方法和试剂国内外少见 报道。乳胶凝集试验是以聚苯乙烯乳胶颗粒为载体，将抗原或抗体吸附到载体上，用以检测 相应的抗体或抗原的方法。该方法操作简便，方便快捷，价格低廉，不需要特殊仪器，肉眼可 判断结果，适合现场快速检测，在临床检测中应用广泛。常用的致敏乳胶的方式主要是物理 吸附法和化学交联法，物理吸附法稳定性和敏感性较低，难以适合产品开发的需要。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种快速检测肠出血性大肠杆菌 0157:H7乳胶凝集检测试剂盒，该试剂盒选择抗肠出血性大肠杆菌0157:H7Intimin蛋白单 克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯乳胶试剂，并以该乳胶检测试剂为核心组装了一种用于检测肠 出血性大肠杆菌〇157:H7的试剂盒，该试剂盒可快速检测肠出血性大肠杆菌0157:H7,对该 病的流行病学调查及防控有重要意义。
[0004]本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为：一种肠出血性大肠杆菌 〇157:H7乳胶凝集检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)乳胶检测试剂、b)样品处理 液、c)阳性对照样品、d)阴性对照样品，所述的乳胶检测试剂是能与肠出血性大肠杆菌 0157:H7特异性反应的乳胶试剂，采用抗Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化聚苯乙烯乳胶 所得。
[0005]按上述方案，所述的抗Intimin蛋白单克隆抗体的制备方法是：从已经建株的5株 杂交瘤细胞中筛选1株抗体效价高、特异性强的杂交瘤细胞扩大培养，同时在BALB/c小鼠 体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体；取8周龄的BALB/c小鼠20只，腹腔注射不完全佛氏佐 剂0. 5mL/只，7d后腹腔注射扩大培养的杂交瘤细胞5X106~5X10 7/只，饲养观察，待小 鼠腹部凸起且行动迟缓时逐只抽取小鼠腹水，2000r/min离心8min，弃去脂肪收集上层澄 清腹水，用间接ELISA方法测定收集的每只小鼠腹水效价，将效价不低于1: (1000X211)的 腹水混合，混合后的腹水经测定最终效价为1: (1000X212)，亚型鉴定为lgG2b。
[0006] 所述的抗Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化聚苯乙稀乳胶的具体制备方法：（1) 取摇匀的羧化聚苯乙烯乳胶200ul放入EP管中；（2)用pH9.6,0. 1M碳酸盐缓冲液洗3遍， 12000rpm，15min，离心弃上清；（3)再用pH4. 5,0. 01M的磷酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm， 15min，离心，弃上清；（4)然后加入lOOmM的EDC1000uL、20mM的NHSlOOOuL重悬，混匀， 使两者的终浓度分别为50mol/L及10m〇l/L，于摇床中26°C缓慢震摇4. 5h; (5)用pH8. 0， 0. 01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpin，20min，离心弃上清；（6)用pH8. 0,0. 01M硼酸盐缓 冲液1000ul悬浮，悬浮乳胶浓度为2%，4°C保存备用；（7)逐滴缓慢加入1:4倍稀释的抗 肠出血性大肠杆菌0157:H7Intimin蛋白单克隆抗体1000ul，所述蛋白单克隆抗体的蛋白 含量2. 78mg/mL，加样时间控制为1小时，于26°C摇床中缓慢震摇5h; (8)加入0. 1M乙醇 胺100ul，于26°C摇床中缓慢震摇15min终止反应，12000rpm，20min，离心弃上清；（9)沉淀 用pH8. 0,0. 01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpin，20min，离心弃上清；（10)沉淀用pH8. 0， 0. 01M硼酸盐缓冲液2000ul悬浮，即为致敏好的乳胶检测试剂，4°C保存。
[0007] 按上述方案，所述的样品处理液的组分及含量按重量/体积为：称取胰蛋白胨 20. 0g, 3号胆盐1. 12g，乳糖5. 0g，无水磷酸氢二钾4. 0g，无水磷酸二氢钾1. 5g,NaCl5. 0g， 将上述成分溶于l〇〇〇mlddH20,调pH值为6. 9±1，121°C高压灭菌15min，取出过滤灭菌的 新生霉素溶液20mg/L加入，使最终浓度为20ug/L。
[0008] 按上述方案，所述的阳性对照样品为灭活的肠出血性大肠杆菌0157:H7菌悬液， 所述的阴性对照样品为不含大肠杆菌〇157:H7高压灭菌的TSB培养液。
[0009] 本发明选用化学交联法，利用带有羧基基团（-C00H)的羧化聚苯乙烯乳胶为载 体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺（EDAC)为介质，通过化学反应将抗体分子偶联到乳胶 表面，其稳定性和敏感性有很大的提高。Intimin蛋白（即紧密素）是大肠杆菌0157:H7LEE 毒力岛上的eae基因编码的外膜蛋白，其介导细菌与上皮细胞的紧密黏附，是最重要的黏 附因子，紧密素的特异性抗体可阻断细菌的黏附而使其丧失致病力，具有较强的免疫原性 和免疫保护性。为此，选择抗肠出血性大肠杆菌〇157:H7Intimin蛋白单克隆抗体致敏羧化 聚苯乙烯乳胶作为本发明乳胶检测试剂，组装简便快速的试剂盒。
[0010] 本发明的肠出血性大肠杆菌0157:H7乳胶凝集检测试剂盒的应用，其特征在于包 括以下具体步骤：1)将收集到的待检样品于样品处理液中37°C培养4-6小时；2)于干净的 玻片或玻板上分别滴加l〇ul阳性对照样品、10ul阴性对照样品和10ul待检样品，然后再向 阳性对照样品、阴性对照样品、待检样品中滴加l〇ul所述的乳胶检测试剂，充分混匀，缓慢 摇动，1分钟后在蓝色背景下观察结果；3)结果判定：对照试验1分钟出现如下结果，试验 方可成立：阳性对照样品与乳胶检测试剂作用出现+++以上的乳胶凝集，阴性对照样品与 乳胶检测试剂作用不凝集；待检样品在1分钟内出现++以上的乳胶凝集判为阳性，呈现原 有均匀乳状判定为阴性。
[0011] 本发明的检测试剂盒能直接对样本中的肠出血性大肠杆菌〇157:H7进行检测，若 样品中含有肠出血性肠出血性大肠杆菌〇157:H7,则乳胶检测试剂在1分钟内出现++以上 的乳胶凝集，即可判为阳性结果；若样品中不含有肠出血性大肠杆菌〇157:H7,则乳胶检测 试剂在1分钟内液滴仍然呈现原有的均匀乳状，即可判为阴性结果。
[0012] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0013] 1、本发明的检测试剂盒无需专门操作技能和任何特殊仪器设备，操作简单、方便 快捷、检测成本低，适合现场的快速检测；
[0014] 2、本发明的检测试剂盒克服了乳胶致敏抗体时偶联率低、抗体容易脱落等缺点， 提高了抗体的偶联率和乳胶检测试剂的敏感性和稳定性，适合产品研发和大规模生产的要 求；
[0015] 3、本发明的检测试剂盒能直接对样品中肠出血性大肠杆菌0157:H7进行检测，具 有特异性强、灵敏度高、检测时间短的特点。
【附图说明】
[0016] 图1为乳胶凝集结果判定图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0018] 实施例1抗肠出血性大肠杆菌0157:H7intimin蛋白单克隆抗体致敏乳胶试剂的 制备
[0019] 抗Intimin蛋白单克隆抗体的制备方法是：从已经建株的5株杂交瘤细胞中筛选 1株抗体效价高、特异性强的杂交瘤细胞扩大培养，同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水 生产单克隆抗体；取8周龄的BALB/c小鼠20只，腹腔注射不完全佛氏佐剂0. 5mL/只，7d后 腹腔注射扩大培养的杂交瘤细胞5X106~5X10V只，饲养观察，待小鼠腹部凸起且行动迟 缓时逐只抽取小鼠腹水，2000r/min离心8min，弃去脂