用于原位检测核酸的超灵敏方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请是申请日为2011年10月21日，申请号为201180062037. 1，发明名称为 "用于原位检测核酸的超灵敏方法"的中国发明专利申请的分案申请。本申请要求于2010 年10月21日提交的代理人卷号no. 12790-021-888的标题为"用于原位检测核酸的超 灵敏方法（ULTRASENSITIVEMETHODFORINSITUDETECTIONOFNUCLEICACIDS) " 的 美国临时专利申请第61/405, 503号（Wu等人）和2010年11月10日提交的代理人卷号 no. 12790-022-888的标题为"用于原位检测核酸的超灵敏方法（ULTRASENSITIVEMETHOD FORINSITUDETECTIONOFNUCLEICACIDS)" 的美国临时专利申请第 61/412, 276 号（Wu 等人）的优先权和权益。这些申请中的每一个均出于各种目的以其全部内容以引用方式并 入本文。
技术领域
[0003] 本发明总体上涉及核酸化学和生物化学测定。更具体地，本发明涉及用于原位检 测样品中核酸分析物的方法。
【背景技术】
[0004] 原位杂交（ISH)是一种允许检测和定位保存形态的单个细胞、组织学组织切片或 染色体制备中的特定核酸分子的技术。在1969年首次描述了这种技术，并且该技术基于 核苷酸探针与细胞中DNA或RNA的特异性目标序列的互补杂交。其可以是内源DNA、信使 RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、病毒序列或细菌序列。用报告分子标记所加入的探针，并且通 过荧光（荧光原位杂交，FISH)或显色（显色原位杂交，CISH)使结合位点可见。
[0005] 在人类全基因组测序完成后，近年来在公共数据库和非公共数据库中已注释了成 千上万个新的人基因序列。由于它相对容易、快速并且廉价地设计并合成了用于检测细胞 中任何新基因的特定序列的反义探针，因此这为ISH打开了新的大门。通过ISH可以获得 基因的组织特异性和细胞类型特异性表达模式以及表达水平，这将为分析基因功能提供有 价值的信息。
[0006] 然而，由于ISH技术的灵敏度和特异性较差而不能检测细胞中低拷贝数的DNA或 RNA靶标，这会限制它们的应用。将ISH应用于临床标准是特别困难的，其中使用福尔马林 固定和石蜡包埋（FFPE)来保存临床组织样品是世界上最常使用的方法。FFPE法良好地保 存了组织形态，但是通过甲醛的交联固定会导致目标序列与检测探针的可接近性较差，探 针分子与其他分子或结构之间的化学或物理相互作用较差，以及对核酸（尤其是mRNA)的 损伤。
[0007] 为了克服ISH的限制并扩展它在诊断病理学中的应用，已开发了几种策略以改善 ISH的灵敏度。最近，AdvancedCellDiagnostics,Inc.开发出 了称为RNAscope?的新 型ISH信号放大方法（美国专利第7, 709, 198号）。这种测定包括独特设计的低聚捕获探针 以及由预扩增子（preamplifier)、扩增子（amplifier)和标记探针组成的信号放大系统， 从而使得能够在不放大背景信号的情况下显著放大信号，并能够对几乎任何基因进行单个RNA分子检测。在图1中示意地说明了RNAscope?技术的示例性实施方式并且将在本申 请的第二部分中详细说明。
[0008] 在用于检测目标核酸的典型RNAscope?测定中，待检测其表达的目标mRNA从 细胞中释放并被到固体表面（例如，微量滴定板的孔）上。还提供了一组两个或更多个捕 获探针和信号产生多聚体。所述捕获探针与目标核酸和信号产生多聚体两者杂交，并因此 将信号产生多聚体捕获至目标核酸。所述信号产生多聚体包含标记探针（LP)。但是更通常 地，除标记探针外，所述信号产生多聚体包含预扩增子和/或扩增子。所述标记探针能够结 合至提供可检测信号的标记颗粒或分子。标记探针具有使得能够连接多个标记颗粒或分子 的较大分子结构，其提供了比单个标记颗粒或分子更强的信号。因此，RNAscope?改善了 核酸检测的灵敏度和特异性。
[0009] 然而，单独利用RNAscope?仍不能可靠地检测以往的其中RNA被显著降解 的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE)的组织切片中的一些低拷贝基因。另外，使用当前的 RNAscope?技术不能使单个RNA分子以40X放大显象。期望进一步增强检测信号以使 得能够更稳健地检测任何RNA分子，包括显著降解的RNA分子，并允许对所检测的RNA信号 以10X放大容易地显像。
[0010] 在本申请中，我们描述了新型ISH信号放大测定以通过将两种信号放大方法合并 到一个系统中来扩展ISH在诊断病理学中的应用。该系统具有三种形式：（1)RNAscope? 与生物素-(抗生蛋白链菌素）抗生物素蛋白组合，（2) RNAscope'?与抗体组合， (3) RNAscope?与酪胺信号放大（TSA)组合。所有这些方法能够利用RNAscope?技术 优越的特异性和三种放大方法的放大能力。我们出人意料地发现上述三种组合信号放大方 法能够显著放大与样品中目标核酸的存在有关的信号并同时具有优异的信噪比。
[0011] 基于两种分子对彼此具有非常高的亲合力，并且一个抗生物素蛋白/抗生蛋白链 菌素分子可以结合四个生物素分子这一事实，生物素-抗生物素蛋白（或生物素-抗生蛋 白链菌素）是一种公知的信号放大系统。抗体在免疫组织化学和ISH中被广泛用于信号放 大。TSA基于通过过氧化物酶活性的多个半抗原酪胺分子的沉积。酪胺是酚类化合物。在 存在少量过氧化氢的情况下，固定化辣根过氧化物酶（HRP)将标记的底物转化为存活期短 的（short-lived)、反应性极强的中间体。然后，在过氧化物酶结合位点处或附近，活化的底 物分子极快速地与蛋白质的富电子部分（如酪氨酸）反应并与其共价结合。以这种方式， 能够在杂交位点原位引入结合至酪胺的大量额外的半抗原分子。随后，可以直接或间接地 使沉积的酪胺-半抗原分子显象。
[0012] 已在ISH中使用了所有这些信号放大方法并获得了不同程度的成功，但是通常对 于日常诊断病理学而言，信号强度和/或信噪比还不够好。就TSA而言，具体地，当在ISH 中单独使用时，产生了大量的背景噪声。每一天和每个实验室的一致性还达不到所期望的 要求。
[0013] 考虑到上述情况，需要以高强度和高特异性地放大核酸的方法。对于这种方法，还 需要其具有高度的一致性。本发明提供了这些和其他特征，可通过阅读以下内容显而易见。
【发明内容】
[0014] 本发明将RNAscope?的信号放大方法与常规ISH信号放大方法组合为超敏感 方法以检测、定量和鉴别样品中的一种或多种目标核酸。由于其独特的成对捕获探针设计， RNAscope?测定提供了优越的特异性。通过将常规ish信号放大方法（例如基于TSA的 信号放大）添加至RNAscope?测定，该组合方法实现了高信号强度和低背景值。本发明 所公开的信号放大方法和系统相对易于使用并且产生一致的结果。所要求保护的方法能够 容易地适合于在常规临床诊断程序中使用。
[0015] 在本发明的一种优选实施方式中，平衡了所公开的信号放大方法的特异性和灵敏 性。通过适度减小RNAscope?中信号放大的倍数实现了这种平衡。在本发明的一种实施 方式中，一个预扩增子被设计为结合1至16个扩增子。在一种优选的实施方式中，一个预 扩增子被设计为结合2至10个扩增子。在另一种更优选的实施方式中，一个预扩增子被设 计为结合2至5个扩增子。
[0016] 在检测样品中目标核酸的优选实施方式中，首先提供包含或怀疑包含所述目标核 酸的样品，以及能够与所述目标核酸杂交的至少一组两个或更多个捕获探针、能够杂交至 该两个或更多个捕获探针的组的信号产生多聚体（其中所述信号产生多聚体包含标记探 针）、和能够结合至所述标记探针的信号放大探针（其中所述信号放大探针包含标记物）。 在所述方法中，首先将目标核酸杂交至两个或更多个捕获探针的组，然后将所述信号产生 多聚体捕获至所述两个或更多个捕获探针的组，并借此将所述信号产生多聚体捕获至所述 目标核酸。然后，将所述信号放大探针捕获至所述标记探针，并借此捕获至所述信号产生多 聚体。在最后一步中，检测信号放大探针中标记物的存在、不存在或量。
[0017] 在一种实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的生物素 分子，能够结合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素分子，以及结合至辣 根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AP)或荧光团并且能够结合至抗生物素蛋白/抗生蛋白 链菌素分子的另外的生物素分子。
[0018] 在另一种实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP、 AP、二硝基苯基（DNP)或荧光团分子，能够结合至所述HRP、AP、DNP或荧光团分子的一种或 多种第一抗体，以及结合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或荧光团并且能够结合所述一 种或多种第一抗体的一种或多种第二抗体。
[0019]在另一种实施方式中，所述信号放大探针包含：能够结合至所述标记探针的HRP分子、多个能够与所述HRP分子反应的酪胺-生物素或酪胺-荧光团分子、以及能够可见地 检测所述酪胺_生物素或酪胺-荧光团分子的检测标记物。所述检测标记物是抗生物素蛋 白/抗生蛋白链菌素-HRP和显色底物的组合或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素-AP和显 色底物的组合。所述显色底物选自：二氨基联苯胺（DAB)和固红。
[0020] 在一种实施方式中，所述信号产生多聚体包含能够杂交至两个或更多个捕获探针 的组的标记探针。在另一种实施方式中，所述信号产生多聚体包含标记探针和杂交至所述 标记探针的扩增子。所述扩增子能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的组。在一种优选 的实施方式中，所述信号产生多聚体包含标记探针、杂交至所述标记物的扩增子和杂交至 一种或多种扩增子的预扩增子。所述预扩增子能够杂交至所述两个或更多个捕获探针的 组。
[0021] 所述目标核酸可以是任何类型的，例如，DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA 和/或等等。
[0022] 在一种实施方式中，可以在进行杂交之前在固体载体上发生放大。
[002