一种大豆球蛋白的直接elisa检测法的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学检测技术领域，尤其设及检测法检测法的构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 大豆抗原蛋白是指大豆及其制品中含有的一些能引起人或畜禽发生过敏反应大 分子蛋白质或糖蛋白。其中，大豆球蛋白（Glycinin)是大豆中主要抗原蛋白之一。畜禽生 产中，摄入含有大豆的日粮后能够引起仔猪和辖牛等幼龄动物呈现腹泻、生长受阻、肠粘膜 细胞增生等过敏反应的现象普遍存在。随着大豆及其制品广泛应用于人类食品和动物饲料 行业，建立快速检测大豆抗原蛋白的方法势在必行。
[0003] 目前，大豆抗原蛋白的检测方法有很多，例如，蛋白质免疫印迹（WesternBlot)具 有高特异性和敏感性等优点，但是在试验的过程中具有耗时长，成本高等弊端，因此在一些 常规的生产检测中受到了限制。PCR技术（Polymerase化ainReaction),是一种分子生物 学技术，用于放大特定的DNA片段，但在后期在使用DNA含量、质量和提取量等等技术过程 中都会使PCR技术受到影响，因此就阻碍了此项技术发展和推广。HPLC(高效液相色谱法） 在使用上比较消耗时间并且仪器相对昂贵，不适合实际生产中的应用，W上方法均具有一 定的高效性和敏感性，但费用高，耗时长，不适于生产中大量样品的快速分析。
[0004] 酶联免疫吸附试验，具有操作简单、快速、灵敏度高，特异性强，适合批量检测等优 点已得到了广泛的认可，目前常见的方法有双抗夹屯、法和竞争法，但该些方法在抗体和蛋 白标准品的使用量上无形的增加了检测成本。
[0005] 因此本发明通过建立直接化ISA法来检测大豆球蛋白，除了节约检测成本外，检 测步骤也较其它化ISA法简化，可W达到快速、低成本的批量样品检测，此方法可应用于 食品及饲料行业中过敏蛋白的检测。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种大豆球蛋白的直接化ISA检测法的构建 方法，得到大豆球蛋白的直接化ISA检测法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种大豆球蛋白的直接化ISA检测法的构建 方法，包括W下步骤：
[0008] (1)包被抗原的获取；用包被缓冲液稀释不同浓度的大豆球蛋白，在聚苯己締板的 反应孔中加100y1，4°C过夜，洗漆，获得包被抗原；
[000引脚封闭海孔加入封闭液于37 °C进行封闭，封闭时间为1~2h，洗漆；
[0010] (3)加样；加入不同浓度的大豆球蛋白特异多隆抗体与相应的抗原结合，每孔 lOOy1，置37°C解育比，洗漆。
[0011] (4)加酶标二抗；将辣根过氧化酶标记抗兔IgG用抗体稀释液稀释成不同的浓度， 取100 加入不同反应孔中，37°C，酶标二抗作用时间为1~化，洗漆；
[0012] 脚加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100y1，37°C，底物 液作用时间为15min~25min;
[0013] 做终止反应；于各反应孔中加入2M硫酸50y1;
[0014] (7)绘制标准曲线。
[0015] 所述包被抗原的最佳包被浓度为1yg/ml，大豆球蛋白特异多隆抗体的最佳稀释 为1 ;800倍稀释，所述稀释液为碳酸纳缓冲液，所述封闭液为1 %的牛血清蛋白，所述封闭 时间为60. 42min，所述酶标二抗作用时间为149. 63min，所述底物液作用时间的最佳组合 为 15. 03min。
[0016] 本发明同时提供上述大豆球蛋白的直接化ISA检测法的应用，包括W下步骤：
[0017] 将待测大豆球蛋白溶液先后与大豆球蛋白特异多克隆一抗，将酶标记抗兔IgG作 为酶标二抗反应，再加入底物液显色，利用标准曲线检测大豆球蛋白溶液中大豆球蛋白含 量。
[0018] 本实验W简单、快捷、灵敏，成本低等作为试验宗旨建立直接化ISA法，并优化了 检测条件。通过优化结果显示，过大豆球蛋白直接化ISA检测法，具有特异性强、灵敏度高、 重复性好、价格低廉、周期性短等特点，适于快速批量的定性或定量检测，可广泛应用于食 品及饲料行业中过敏蛋白的检测。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步具体说明。
[0020] 图1为最适包被抗原浓度的筛选曲线图。
[0021] 图2为最适包被抗体浓度的筛选曲线图。
[0022] 图3为具有免疫活性的大豆球蛋白含量检测标准曲线图。
【具体实施方式】
[0023] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部 分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出 创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024] 1材料与方法 [00巧]1. 1主要的试剂
[0026] 大豆球蛋白，兔的多克隆抗体，辣根过氧化酶标记抗兔IgG为酶标二抗，四甲基联 苯胺（TMB)，其他试剂均为分析纯，96孔聚苯己締酶标板；酶标仪，BI0-RADModel680;试 剂；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂；肾上腺素；器材与仪器；Gk88B旋祸混合器；微量移 液器、注射器、剪毛剪、兔子固定架。
[0027] 碳酸纳缓冲液；0.05g化2C03,0. 308gN址C03,定容至500ml。样品处理液 (PB巧：9g化C1, 2. 9g化2HP04, 0. 3gNa肥P04,定容至 1000ml。封闭液（1%BSA) ;0. 1 浊SA 溶于lOmlPBS，储存于 4° 中。PBST;9g化Cl，2. 9g化2HP04,0. 3gNa肥P04,定容至 1000ml， 加0. 5ml吐温20。。终止液；11. 1ml浓硫酸，88. 9ml水。
[002引 2实验方法
[0029] 2. 1多克隆抗体的制备及其纯化
[0030] 制备大豆球蛋白多克隆抗体并进行抗体纯化。
[0031] 2. 2ELISA方法的建立
[0032] 2. 2. 1 -抗和酶标二抗最适浓度的确定
[0033] 用包被缓冲液稀释不同浓度的大豆球蛋白，同时做空白孔和阴性对照孔，在聚苯 己締板的反应孔中加100y1，4°c过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗漆液洗3次，每次3min~ 5min。封闭；每孔加入封闭液于37°C封闭比，同上洗漆=次。加样：加入不同浓度的大豆球 蛋白兔多克隆抗体与相应的抗原结合。每孔100yl，置37°C解育比。然后洗漆。加酶标 二抗；将羊抗兔酶标二抗用抗体稀释液稀释成不同的浓度。取100y1加入不同反应孔中， 37°C解育比，洗漆。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100y1， 37°C反应15min~25min。终止反应；于各反应孔中加入2M硫酸50]il。结果判断；在酶 标仪上，于492皿处，测各孔0D值，W阳性对照约为1. 0,阴照小于0. 1，且阳性/阴性（P/ 脚> 2的条件作最适条件，据此选择包被抗原和一抗体的工作浓度。
[0034] 2. 2. 2标准曲线的确定
[0035] 根据确定的包被抗原和一抗的最适稀释浓度，进行ELISA检测系列浓度 (20,40. 80, 160, 320, 640ng/mL)的大豆球蛋白，在酶标仪上，于492皿处，测各孔0D值。W 大豆球蛋白浓度为横坐标，W〇D492nm值为纵坐标，绘制标准曲线，确定检测范围。W抗原 浓度和0D492nm值成正相关的范围为检测范围，绘制标准曲线。
[0036] 2. 2. 3重复性的确定
[0037] (1)板内变异系数
[0038] 根据之前确定的包被抗原和一抗的最适稀释浓度，将大豆抗原蛋白做=个不同的 浓度梯度在同一块96孔酶标板上测定其492nm处的0D值，每个浓度做6个重复，计算建立 ELISA方法的板内变异系数，变异系数（CV%)=标准差（SD)/平均值。
[00測 似板间变异系数
[0040] 根据之前确定包被一抗和酶标二抗的最适稀释浓度，将大豆抗原蛋白做=个不同 的浓度梯度用6块酶标进行化ISA，同一酶标板内每个浓度重复6次。测定0D492值，计算 建立化ISA方法的）板间变异系数。变异系数（CV%)=标准差（SD)/平均值。
[00川 2. 2. 4封闭时间、酶标抗体作用时间、底物作用时间的确定
[0042] 在上述指标确定的前提下，根据实验设计，采用不同的封闭时间、酶标二抗 作用时间、底物作用时间S水平S因素正交进行了 15次单因素实验，之后利用采用 Design-ExpertS. 0化软件进行设计正交实验15组，得出数据进行分析，用W估计试验误 差，得出最佳封闭时间、酶标二抗作用时间、底物作用时间的最佳组合。
[0043] 表1直接ELISA正交试验因素水平表
[0044]
【主权项】
1. 一种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，包括以下步骤： ⑴包被抗原的获取：用包被缓冲液稀释不同浓度的大豆球蛋白，在聚苯乙烯板的反应 孔中加100 y 1，4°C过夜，洗绦，获得包被抗原； ⑵封闭：每孔加入封闭液于37°C进行封闭，封闭时间为1~2h，洗涤； ⑶加样：加入不同浓度的大豆球蛋白特异多隆抗体与相应的抗原结合，每孔IOOy 1， 置37°C孵育lh，洗涤； ⑷加酶标二抗：将辣根过氧化酶标记抗兔IgG用抗体稀释液稀释5000倍，取100 y 1加 入不同反应孔中，37°C，酶标二抗作用时间为2h，洗涤； (5) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100 y 1，37°C，底物液作 用时间为15min~25min ; (6) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50 y 1 ; (7) 绘制标准曲线。
2. 根据权利要求1所述的大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，所述包被抗原 的最佳包被浓度为I U g/ml，大豆球蛋白特异多隆抗体的最佳稀释为I :800倍稀释。
3. 根据权利要求1所述的大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，所述稀释液为 碳酸纳缓冲液，所述封闭液为1 %的牛血清蛋白。
4. 根据权利要求1所述的大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，所述封闭时间 为 60. 42min。
5. 根据权利要求1所述的大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，所述酶标二抗 作用时间为149. 63min。
6. 根据权利要求1所述的大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法，所述底物液作 用时间的最佳组合为15. 03min。
7. -种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的应用，其特征在于，包括以下步骤： 将待测大豆球蛋白溶液先后与大豆球蛋白特异多克隆一抗，将酶标记抗兔IgG作为酶 标二抗反应，再加入底物液显色，利用标准曲线检测大豆球蛋白溶液中大豆球蛋白含量。
【专利摘要】本发明涉及一种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法及应用。所述一种大豆球蛋白的直接ELISA检测法的构建方法通过优化直接ELISA检测法的参数，包括包被抗原为1μg/mL，抗体最适稀释度1：800；最佳封闭时间为60.42min，酶标抗体最佳反应时间为149.63min，底物液作用最佳反应时间为15.03min，最终绘制直接ELISA检测法的标准曲线。在应用直接ELISA检测法测量时，将待测大豆球蛋白溶液先后与大豆球蛋白特异多克隆一抗、将酶标记抗兔IgG作为酶标二抗进行反应，再加入底物液显色，用标准曲线进行判断，直接得到待测大豆球蛋白溶液的大豆球蛋白含量。该检测方法具有简单，快速、成本低，耗时短等特点，可应用于大豆及其深加工产品中大豆球蛋白含量的检测。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104865388
【申请号】CN201510271474
【发明人】赵元, 鲍男, 张诗尧, 秦贵信, 娜仁高娃, 车东升
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月25日