提取样品中肌醇的方法、试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析技术领域，涉及一种提取样品中肌醇的方法、试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 肌醇（Inositol)，又称1，2, 3, 4, 5, 6-环己六醇，最早从心肌和肝脏中分离得到， 分子式为C6H1206，结构如式I所不。
[0004] 肌醇广泛分布在动植物体内，是参与新陈代谢活动的"生物活素"，具有免疫、预防 和治疗某些疾病的作用。高等动物若缺乏肌醇，将会出现生长停滞和毛发脱落等现象，人体 对肌醇的需求量是l-2g/天，许多保健饮料和儿童食品都添加有微量肌醇。肌醇还是肠内 某些微生物的生长因子，在其它维生素缺乏时，它能刺激微生物合成所缺乏的维生素。在发 酵和食品工业中，肌醇可用于多菌种培养、促进酵母增长。此外，烟草中的肌醇含量较高，在 0. 1%~1%之间，不同地区与品种的烟叶其肌醇含量略有差别。
[0005] 目前，用于肌醇的检测方法主要有重量法、微生物法、高碘酸钾氧化法、示差折光 法、高效液相色谱法和气相色谱法等。其中，重量法易污染环境；高碘酸钾氧化法不能排除 邻二醇化合物的干扰、专属性较差；示差折光检测法所用仪器不稳定、干扰因素多；高效液 相色谱法对于成分复杂样品分离效果差。而且，目前肌醇检测方法的前处理均存在提取步 骤繁琐、时间较长等问题，尤其是由于肌醇沸点高，采用气相色谱法时需进行柱前衍生化， 将其制备成低沸点酯类后才能进行测定，前处理较为复杂。
[0006] 目前尚需一种简便的前处理方法，以快速提取出样品尤其是烟草或烟草制品中的 肌醇。
【发明内容】
[0007] 本发明人得到了一种快速提取样品中肌醇的方法，尤其适用于对肌醇含量较高的 烟草或烟草制品进行提取，该方法快速简便、选择性好、重现性好。此外，发明人还首次采用 液相色谱-质谱联用法对提取液中的肌醇进行检测，灵敏度高。
[0008] 本发明第一方面涉及一种提取样品中肌醇的方法，包括如下步骤：用乙酸铵水溶 液浸润样品，得到提取液。
[0009] 所述浸润指乙酸铵水溶液与样品发生接触时，液体附着在样品表面或渗透到样品 内部的现象。具体地，浸润时，乙酸铵水溶液液面至少为样品高度的1/3或至少为样品高度 的1/2,优选，乙酸铵水溶液完全浸没样品。
[0010] 本发明第一方面任一项的方法中，所述样品为烟草或烟草制品。
[0011] 发明人发现，提取溶剂的选择对肌醇分析有显著影响，乙酸铵水溶液能将 样品中的肌醇快速提取出来，提取率高且方法简单。而采用其他的磷酸钠缓冲溶液 (NaH2P04-Na2HP04)、磷酸钾缓冲溶液（K2HP04-KH2P04)等无法对样品中的肌醇进行有效的提 取分析。
[0012] 本发明第一方面任一项的方法中，所述乙酸铵水溶液的浓度为0. 09-0. 15mol/L， 具体为 〇? 1-0. 15mol/L或 0? 12-0. 15mol/L，优选为 0?lmol/L。
[0013] 乙酸铵水溶液的浓度为0. 09-0. 15mol/L，可基本完全提取出样品中的肌醇。
[0014] 本发明第一方面任一项的方法中，向每克所述样品中添加乙酸铵水溶液的量为 250-1000mL，具体为 250mL、500mL、750mL或 1000mL，优选为 500mL/g。
[0015] 发明人发现，乙酸铵水溶液添加量过大时，信号微弱，容易受基线噪音的影响；添 加量过小时，对于肌醇含量高的样品，容易出现信号值过饱和、测定不准确的问题。将乙酸 铵水溶液添加量控制在250-1000mL/g，尤其是500mL/g，可以保有正常信号值，使测量准 确，同时合适的乙酸铵水溶液添加量能够使肌醇被均匀提取出来。
[0016] 本发明第一方面任一项的方法中，浸润时间多lOmin，具体地，浸润时间多30min、 多40min或多50min，优选为30min。
[0017] 本发明第一方面任一项的方法中，所述浸润在超声下进行；具体地，超声功率为最 大功率的40 % ;更具体地，浸润温度为30-60 °C，具体为30 °C、40 °C、50 °C或60 °C。
[0018] 本发明第一方面任一项的方法中，还包括将提取液进行过滤的步骤；具体地，以水 相滤膜过滤提取液；更具体地，所述水相滤膜的孔径为0. 22ym。
[0019] 本发明第一方面任一项的方法中，还包括采用液相色谱-质谱分析提取液的步 骤。
[0020] 根据本发明任一的方法，液相色谱条件为如下（1)_(6)中的任意一项或者多项：
[0021] (1)色谱柱为菲罗门（V液相色谱柱；
[0022] (2)进样量为 5yL;
[0023] (3)流动相为0? 1 %醋酸水溶液；
[0024] (4)流速为 0? 8mL/min;
[0025] ⑶柱温为40°C;
[0026] (6)采用等度洗脱程序，洗脱时间3min。
[0027] 发明人发现采用菲罗门C18液相色谱柱分析提取液，得到的色谱峰型较好、响应值 较高；色谱峰响应值随着进样量增加而增加，但发明人发现进样量过高时，肌醇色谱峰出现 裂缝，影响了检测的准确性；以〇. 1 %醋酸水溶液作流动相，色谱峰值较好、响应值较高。
[0028] 根据本发明任一的方法，质谱条件为如下（1)_(7)中的任意一项或者多项：
[0029] (1)扫描方式为负离子扫描；
[0030] (2)定量离子对179/87,定性离子对179/59 ;
[0031] (3)碰撞能为-25V;
[0032] (4)离子源为电喷雾电离源；
[0033] (5)检测方式为多反应检测；
[0034] (6)电喷雾电压为-4500V;
[0035] (7)离子源温度为55(TC。
[0036] 以负离子方式扫描，碰撞能为-25V，选择定量离子对179/87,定性离子对179/59 进行检测，准确度高、灵敏度高、回收率高、重复性好。选择其他碰撞能和定量离子对检测时 准确度较低。
[0037] 本发明第二方面涉及一种提取样品中肌醇的试剂盒，包括乙酸铵水溶液和水相滤 膜。
[0038] 本发明第二方面任一的试剂盒，包括如下（1)_(5)中任意的一项或者多项：
[0039] (1)所述乙酸铵水溶液的浓度为0? 09-0. 15mol/L，优选为0?lmol/L;
[0040] (2)乙酸铵水溶液的量至少为250mL，具体为250-1000mL，优选为500mL;
[0041] (3)所述水相滤膜的孔径为0? 22ym;
[0042] (4)所述试剂盒为定量分析试剂盒；
[0043] (5)所述样品为烟草或烟草制品。
[0044] 本发明第三方面涉及所述试剂盒在提取样品中肌醇，或者在控制样品质量中的用 途；具体地，所述样品为烟草或烟草制品。
[0045] 发明的有益效果
[0046] (1)本发明以乙酸铵水溶液浸润样品，即能从样品特别是烟草或烟草制品中提取 肌醇，方法简单，无需使用有毒性的有机溶剂。
[0047] (2)本发明首次采用液相色谱-质谱联用法分析提取液中的肌醇，快速准确、灵敏 度高、操作简单。
[0048] (3)使用本发明方法提取样品中肌醇的回收率高、重复性好。检测烟草或烟草制 品的样品时，几乎不存在杂峰，目标物线性相关性较好，将标准溶液稀释一定倍数，以信噪 比S/N= 3计算出肌醇的检出限为0. 07mg/g，以信噪比S/N= 10计算出肌醇的定量限为 0. 22mg/g，平均回收率为93. 4 %~94. 9 %，相对标准偏差RSD〈5 %(n= 6)。
【附图说明】
[0049] 图1 :本发明实施例1中分析方法的流程图。
[0050] 图2 :本发明实施例1中标准溶液的色谱图。
[0051] 图3 :本发明实施例1中提取液的色谱图。
[0052] 图4 :本发明实施例1中肌醇的质谱图。
[0053] 图5 :本发明实施例1中肌醇的标准曲线图。
[0054] 图6 :本发明实施例2中不同提取溶剂与色谱峰面积的关系图。
[0055] 图7 :本发明实施例3中添加量为25mL乙酸铵水溶液时的色谱图；
[0056] 图8 :本发明实施例3中添加量为100mL乙酸铵水溶液时的色谱图；
[0057] 图9 :本发明实施例4中不同提取时间与测得的肌醇含量的关系图。
[0058] 图10 :本发明实施例7中纯水作流动相的色谱图。
【具体实施方式】
[0059] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0060] 实施例1 :对烟草制品中肌醇含量的分析
[0061] 分析方法如图1所示：
[0062] (1)配制标准溶液：称取0.lg肌醇，精确至0.OOOlg，用0.lmol/L乙酸铵水溶液溶 解后转移至l〇〇mL棕色容量瓶中定容，配制成lmg/mL标准储备液；分别移取0.lmL、0. 5mL、 lmL、2mL、3mL和5mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用0.lmol/L乙酸铵水溶液定容，得 到肌醇浓度分别为 1yg/mL、5yg/mL、10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL和 50yg/mL的标准溶 液，避光4°C保存，取