一种c反应蛋白胶体金检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒及其制 备方法和用途。
【背景技术】
[0002] C反应蛋白（C-reactive protein，CRP)是由肝脏合成的一个相对分子质量为 1.15X103的五环结构，在它的每一边都有亲钙性结合位点，且其分子代谢周期的半衰期仅 为5-7小时，因此在补体系统的免疫调节中扮演了一个重要的生物学角色。CRP是公认的最 有价值的典型急性时相蛋白，正常血浆水平小于5mg/L，机体受到感染、外伤、肿瘤及理化因 素刺激后5-8小时迅速升高，24小时内峰值可为正常值的数百倍。若感染得到控制CRP可 在24-48小时内迅速下降，1周内恢复正常。CRP可与凋亡细胞、坏死细胞膜磷脂或细菌、真 菌、寄生虫的细胞壁磷酸胆碱结合，激活补体，调理吞噬功能，促使内源性或外源性配体物 质的清除。
[0003] 目前，CRP的测定广泛地应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，特别是快速定量 CRP检测在儿科疾病的诊断中得到较好的应用。在细菌感染急性期CRP水平显著升高，而在 病毒感染时CRP水平正常或轻微升高，因此CRP水平可作为细菌感染或病毒感染首选鉴别 诊断指标；在鉴别呼吸道感染时，细菌性肺炎常导致CRP水平升高到60mg/L以上，而急性支 气管炎很少导致CRP水平的显著升高，所以测定CRP水平有助于鉴别肺炎和支气管炎，减少 对非细菌性急性支气管炎患者予抗生素治疗；外科手术后若病人继发细菌感染特别是化脓 性感染时，CRP明显升高（大于50mg/L)，手术第2天达到高峰，72小时后开始逐步下降，恢 复时间因手术部位和组织损伤程度而异，故CRP还可以作为诊断感染和手术后并发症的一 项指标；此外，研宄还表明CRP还可能与风湿性疾病、系统性红斑狼疮、外科学、妇产科学、 胃肠病学、血液学和肿瘤学等密切相关，应用范围还将不断扩大。
[0004] 超敏C反应蛋白（hypersensitive-CRP，hs-CRP)与普通CRP就是同一种蛋白，只 是由于其测定方法更敏感而得名。采用临床常规方法测定CRP时，检测的线性范围一般为 3-200mg/L，因检测方法缺乏足够的敏感性，无法测出血液中含量更低的CRP。近年来相继采 用胶乳增强的免疫散射比浊法、免疫投射比浊法、免疫发光法等技术使检测的灵敏度得到 了很大提高，检测低限延伸为〇. 005~0. 10mg/L，使得低浓度CRP (如0. 15~10mg/L)的测 定更加准确。
[0005] 近年来关于CRP、hs-CRP的研宄越来越多，应用越来越广泛。在感染、心脑血管性 疾病、糖尿病、代谢综合征、外周血管病、慢性阻塞性肺病、哮喘、肿瘤等多种疾病中用于指 导临床诊疗。目前已经知道，CRP和hs-CRP的临床意义并不完全相同。CRP在感染性疾病 和结缔组织病中有较高的应用价值，而hs-CRP近年来在心脑血管疾病、糖尿病中越来越受 到关注。
[0006] 人类C反应蛋白（C-reactive protein，CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时 血浆中一些急剧上升的蛋白质（急性蛋白）。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而 起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天 然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研宄已经有70多年的历史，传统观点认为 CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研宄揭示了 CRP直接参与了炎症与动脉粥样 硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
[0007] 作为急性时相反应的一个极灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、 感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病 史，有助于随访病程。特别在炎症过程中，随访风湿病、系统性红斑狼疮、白血病等。
[0008] C反应蛋白测试可以鉴别细菌或病毒感染，监测病情，监控术后感染，抗生素疗效 观察，预测心血管病危险等，C反应蛋白对诊断和治疗都很有价值，因此其测定速度就有重 要意义。
【发明内容】
[0009] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种C反应蛋白胶体金检 测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0010] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：
[0011] 本发明的第一方面，提供一种C反应蛋白胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，所述试 纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜 和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素 膜上包被有检测线和质控线。
[0012] 优选的，所述底板为PVC底板。
[0013] 优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样 端较远一侧。
[0014] 优选的，所述检测线包括检测线T1和检测线T2,所述检测线上包被有抗C反应蛋 白单克隆抗体-2。
[0015] 优选的，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。
[0016] 所述抗C反应蛋白单克隆抗体-1和抗C反应蛋白单克隆抗体-2可以是相同的单 克隆抗体，也可以是不同的单克隆抗体。
[0017] 优选的，所述抗C反应蛋白单克隆抗体-1为Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody [CRP135]，所述抗C反应蛋白单克隆抗体-2 为Abeam?Anti-C Reactive Protein antibody [CRP-8] (abl3426)，或所述抗C反应蛋白单克隆抗体-1为Abeam?.Anti-C Reactive Protein antibody[CRP_8](abl3426)，所述抗 C 反应蛋白单克隆抗体 _2 为 Abeam?.Anti-C Reactive Protein antibody [CRP135]。
[0018] 优选的，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲 液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液 的浓度为50-100mM。
[0019] 优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选 自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 10_40mM 〇
[0020] 更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括 NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml。
[0021] 更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0. 25-0. 5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为 4_8mg/ml〇
[0022] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0023] 所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0024] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0025] 优选的，所述试剂盒还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡 卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位 置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
[0026] 更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。
[0027] 优选的，所述检测试剂盒用于检测样品中的C反应蛋白，所述样品选自人全血、血 清或血浆中的一种或多种的组合。
[0028] 本发明第二方面提供所述C反应蛋白胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步 骤：
[0029] 1)用胶体金标记的抗C反应蛋白单克隆抗体-1溶液喷涂金标垫，制得包含抗C反 应蛋白单克隆抗体-1的金标垫；
[0030] 2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗C反应蛋白单克隆抗体-2及 羊抗鼠IgG，制得包被后的硝酸纤维素膜；
[0031] 3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴 在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
[0032] 优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选 自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为 10_40mM 〇
[0033] 更优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，所述缓冲液还包括 NaCl和冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种 的组合，NaCl在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为0. l-20mg/ml。
[0034] 更优选的，NaCl在缓冲液中的浓度为0.25-0. 5mg/ml，冠醚在缓冲液中的浓度为 4_8mg/ml〇
[0035] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0036] 所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1. 5~2h，取出放于36~ 38°C烘干。
[0037] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0038] 本发明第三方面提供所述C反应蛋白胶体金检测试剂盒在C反应蛋白检测领域的 用途。
[0039]本发明的有益效果为：
[0040] 本发明所提供的C反应蛋白胶体金检测试剂盒兼具高灵敏性和高特异性，能够快 速检测C反应蛋白。此外，所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。
【具体实施方式】
[0041] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0042] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0043] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0044] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技