一种检测糖化血红蛋白的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖化血红蛋白检测技术领域，具体涉及一种检测糖化血红蛋白的试剂 盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢疾病，目前发病率仅次 于心血管疾病和肿瘤。最近几年糖尿病的发病率呈不断上升趋势，是严重威胁人类健康 的世界性公共卫生问题。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服 葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平。近车来，糖化血红蛋白 (HbAlC)的检测日益受到临床的高度重视。糖化血红蛋白（HbAlC)是指血液中和葡萄糖结 合了的那一部分血红蛋白。血红蛋白0亚基N端的缬氨酸的氨基与葡萄糖的自由醛基可 逆缩合为醛亚胺(席夫碱)，而后醛亚胺发生Amadori重排反应，形成较为稳定的N末端果糖 基结构及顺式二醇结构单元。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的糖化血红蛋白含 量也会较高。人体内红细胞的寿命一般为120天，在红细胞死亡之前，血液中糖化血红蛋白 (HbAlC)含量也保持相对不变。糖化血红蛋白（HbAlC)水平反应了检测前120天内的平均 血糖水平，而与取血时间、病人是否空腹及是否使用胰岛素等因素无关，因此，糖化血红蛋 白（HbAlC)是反应长期血糖水平的金标准，也是糖尿病辅助诊断、监测、治疗的重要指标。
[0003] 糖化血红蛋白（HbAlC)的测定方法多种多样，总体来说可分为两大类：一类是基 于HbAlC和Hb的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于Hb上糖化基团的结 构特点，如亲和层析法、免疫法和酶法等。
[0004] 多个研宄表明原理和方法学上的差异决定了检测试剂性能的优劣，而糖尿病患者 治疗目标要求测定值不受测定方法的影响，因此在实验室里应用不同GHb测定方法所产生 的结果可比性非常重要。
[0005] 离子交换层析法：主要有高效液相色谱法（HPLC)和手工微柱法。此方法是基于血 红蛋白0链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立。但由于此方法所使用的仪器昂贵， 难以在比较基层的医院和实验室普及；微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量 不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变 化敏感，HbF及变异血红蛋白（HbS、HbC、HbE等）对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而 定，所以一定要仔细观察图谱。
[0006] 电泳法：以琼脂凝胶电泳为例，Hb于酸性缓冲液条件下（pH6. 0)在琼脂糖凝胶上 的电泳迀移取决于Hb在凝胶上的吸附情况及其所带的电荷。该方法标本用量少，分辨率 高，重复性好，有研宄发现血糖值与HbAlc值有显著相关性，且结果不受温度及胎儿血红蛋 白的影响。另外，因为它可测定的Hb线性范围较宽（13.0~39.0g/L)，可发现异常Hb。该 方法的缺点是每次测定均需成批进行样本分析，速度比较慢，无法进行实时个体检测，自动 化程度较差，所测结果与技术人员扫描和对电泳的波峰判断有关，受主观因素影响，并且费 用昂贵，因此并不适合临床实验室常规使用。
[0007] 亲和层析法：硼酸具有与整合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应 的性质。通常使用的是间-氨基苯硼酸琼脂糖，将血样本加到层析柱后，所有的GHb与硼酸 结合留在柱中，非GHb直接流出层析柱；再加入高浓度也包含顺位二醇基的多羟基复合物 (如山梨醇)，GHb与硼酸的结合被替换而被洗脱下来，分别测量两组分，并计算比值。亲和层 析法对变异血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对其他方法不敏感，但测定的是HbAl即GHb 总量。另外，金标法和硼酸亲和层析法密切相关，操作均简便易行、快速准确、试剂稳定。据 报道，该法不受除Hbs和Hbc之外的任何血红蛋白变异体和降解产物的干扰，结果可靠，比 较适用于临床随时检测。
[0008] 免疫比浊法：利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的e链N末端提供了一个 容易被抗体识别的抗原表位，可以用单克隆抗体或多克隆抗体，特异识别GHb的0链N末 端最后4~6个氨基酸组成的抗原表位，结合比色或比浊法，以GHb为标准，测定HbAlc的 含量，再测定Hb的含量，最后计算出HbAlc占总Hb的百分含量。此类方法只能作为判断糖 尿病血糖水平的指标，不可用于变异血红蛋白的研宄。与其相比，免疫比浊法检测的方法更 为简单，不需要额外添加仪器，为临床提供了一种快速、准确、可靠、简便的常规方法，在临 床应用中有着更为广阔的前景。
[0009] 酶法：全血经溶血处理后，用特异蛋白内切酶将Hb酶解消化成果糖氨基酸，再经 果糖氨基酸氧化酶作用下产生过氧化氢（hydrogen peroxide，H202)，H202的浓度与血液中 GHb的含量成正比，H202在过氧化物酶的作用下与相应的色原耦联，从而根据颜色变化程 度可得H202浓度，进而得知样本中GHb的含量；同时测定同一管消化液的总Hb浓度，计算 GHb和Hb的浓度比值，即为GHb结果。此法提供了一个像临床生化反应一样快速均一的反 应系统(如葡萄糖、谷氨酸氨基转移酶)，有很好的精密度，可同时检测GHb和Hb，且与常规 HPLC法和免疫测定法有很好的相关性。
[0010] 离子捕获法：应用抗原抗体反应原理，并联以荧光标志物，通过连接带负电的多 阴离子复合物，吸附到带正电的的纤维表面，经过一系列彻底清洗等步骤后，测定荧光强度 变化率，计算GHb浓度。其检测系统易于规范和重复，可减少操作技术误差，检测的敏感 度和特异度高，批内、批间变异系数小。有文献报道此法影响因素少，准确度高，回收率达 98. 85%，交叉污染率〈0. 01%。该方法是近几年发展起来的新方法，采用自动分析仪，适用于 批量标本的检测。
[0011] 综上所述的几种方法，要么试剂、仪器成本高，要么操作复杂、要么准确度低，稳定 性差，且均不适合社区及基层医院。因此，需要对现有的测定糖化血红蛋白比例的方法进行 改进，提出一种新方法来解决这些问题。
【发明内容】
[0012] 为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测糖化血 红蛋白的试剂盒，该试剂盒只需要微量的全血活末梢血样本，即可在2-3分钟内实现定量 检测糖化血红蛋白的含量，极大提高了筛查的速度，具有灵敏度高、特异性好和操作简便的 优点；制备方法简单，易于大规模生产。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种检测糖化血红蛋白的检测方法，该检测方法只需 要微量的全血活末梢血样本，即可在2-3分钟内实现定量检测糖化血红蛋白的含量，极大 提高了筛查的速度，具有灵敏度高、特异性好和操作简便的优点。
[0014] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测糖化血红蛋白的试剂盒，所述试 剂盒包括： 第一试剂，该第一试剂包括用于裂解红细胞、释放糖化血红蛋白、沉淀总血红蛋白的硼 酸盐衍生物； 第二试剂，该第二试剂包括用于洗去未结合糖化血红蛋白的硼酸盐衍生物的缓冲液； 以及层析器，该层析器包括用于保留血红蛋白沉淀的反应膜。
[0015] 优选的，所述试剂盒还包括棕色离心管、试剂瓶和铝箔袋，棕色离心管装有第一试 剂，且棕色离心管装在铝箔袋内，试剂瓶装有第二试剂。
[0016] 更为优选的，所述试剂盒还包括包装盒、内衬和毛细采血管，内衬设置于包装盒 内，毛细采血管设置于内衬上。层析器还包括塑料外壳，反应膜固定于塑料外壳的内部中 间，塑料外壳与反应膜组装成层析器，反应膜的孔径为0. 5 ym。
[0017] 第一试剂为硼酸盐衍生物，PH8.0,总量200 yL，置于lmL容量的棕色离心管中；第 二试剂为缓冲液，PH8. 0,总量2mL，置于5mL容量塑料试剂瓶中。
[0018] 本发明的试剂盒只需要微量的全血活末梢血样本，即可在2-3分钟内实现定量检 测糖化血红蛋白的含量，极大提高了筛查的速度，具有灵敏度高、特异性好和操作简便的优 点；制备方法简单，易于大规模生产。
[0019] 优选的，每升所述第一试剂包括如下组分： 硼酸盐衍生物 0. 4-0. 6g 氯化镁 1. 9-2. 9g 氯化钾 22-26g 氯化钡 6. 2-8. 2g 甘氨酰胺盐酸盐 6. 6-8. 6g 甲酰胺 25-35g 叠氮化钾 8-12g 壬基酚聚氧乙烯醚 15-25g 水 余量。
[0020] 优选的，所述硼酸盐衍生物的结构式为：
其中，Ri为吖嗪基，R2为碳原子数为1-6的烷基。
[0021] 优选的，每升所述第二试剂包括如下组分： 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 23_33g 叠氮化钾 4-6g 氯化钠 0? 4-0. 8g 甲酰胺 8-12g 聚乙二醇辛基苯基醚 4-6g 水 余量。
[0022] 本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种用于非治疗目的使用上述所述的 试剂盒检测糖化血红蛋白的检测方法，包括如下步骤： A、 用毛细采血管吸取5 yL血液样本，加入装有200 yL第一试剂的棕色离心管中，上下 颠倒8-12次，充分混匀，于室温下静置l-3min，得到反应液； B、 用移液器吸取25 y L上述反应液滴加在层析器中间的反应膜上； C、 8-12s后，取25 y L第二试剂滴加在层析器中间的反应膜上； D、 8-12s后，将层析器