一种具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于固体废物处理与资源化技术领域，具体涉及一种有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的提取和还原能力的测定方法。
【背景技术】
[0002]有机废弃物在放置和处理过程中会形成胡敏酸类物质，相对于土壤来源的胡敏酸而言，有机废弃物来源的胡敏酸结构不稳定，其中一部分组分可以很快被微生物降解利用。除了作为微生物营养功能外，胡敏酸还可以被氧化和还原，作为电子穿梭体介导电子传递，促进环境介质中污染物的降解和转化。
[0003]胡敏酸稳定还原能力的测定具有重要意义，以生活垃圾堆肥产品为例，当将堆肥施入土壤后，其中一部分作为碳源被降解利用，剩下的部分作为电子穿梭体稳定得到或失去电子，作为氧化剂和还原剂，该部分对于土壤中污染物的降解和转化具有重要意义。
[0004]胡敏酸电子转移能力(即氧化和还原能力)的测定方法有电化学方法、Fe3+氧化法和H2S还原法，在这些方法中，电化学方法可以方便快捷的测定胡敏酸的氧化和还原能力，但是它测定是总的氧化和还原能力，对于有机废弃物来源的不稳定的胡敏酸组分，无法确定其中稳定具有电子转移能力的胡敏酸的量及其电子转移能力。
[0005]一个可能的办法是，先将胡敏酸中不能稳定转移电子有机物组分降解掉，然后获得具有稳定电子转移能力的组分，再采用传统滴定化学或电化学方法测定具有稳定电子转移能力胡敏酸的还原能力。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的提取和还原能力的测定方法，以测定胡敏酸中能稳定进行还原能力的胡敏酸的还原能力。
[0007]为实现上述目的，本发明提供的有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法，其主要步骤为:
[0008]I)提取有机废弃物中粗胡敏酸组分:将NaOH和Na4P2O/混合液加入有机废弃物中，室温下避光震荡，离心后取上清液，用HCl将上清液酸化至pH = 2，静置，离心弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀，直至洗出液无Cl—检出，用磷酸氢二钠缓冲液将胡敏酸沉淀溶解；
[0009]2)保外呼吸菌菌接种与扩繁培养:在超净工作台下接种胞外呼吸细菌至LB液体培养基中，接种后避光摇床培养；
[0010]3)菌悬液离心:将培养好的菌悬液离心弃去上清液，保留菌体沉淀；
[0011]4)菌体重悬:往菌体沉淀中加入无机培养液，在漩涡振荡器中将菌体重悬，得菌悬液；
[0012]5)粗胡敏酸组分的纯化:将菌悬液加入步骤I提取出的粗胡敏酸溶液中，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液，随后向混合液中充氮气将瓶盖密封，避光摇床震荡培养得反应液；
[0013]6)具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取与纯化:将反应液过滤膜，收集滤液，用HCl调反应液的pH = 2，静置后离心，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀至洗液无Cl—检出后，用磷酸二氢钠缓冲液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液；
[0014]7)胡敏酸稳定还原能力的测定:往步骤6所得胡敏酸溶液加入步骤4中的菌悬液，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液。随后往混合液中充氮气将瓶盖密封，避光摇床震荡培养，得反应混合液，取部分反应混合液采用邻菲啰啉法测定混合液中Fe2+的含量，根据加入的Fe3+量与反应后生成的Fe 2+量计算具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力。
[0015]所述的还原能力测定方法，其中，步骤7之后进行胡敏酸稳定还原能力的验证:将步骤7中所得的反应混合液剩余部分过滤膜，重复步骤6和7，再测定胡敏酸的还原能力，并重复数次，若数次测定值相差小于10%，即证明所测的为胡敏酸的稳定还原能力。
[0016]所述的还原能力测定方法，其中，步骤I中的NaOH和Na4P2O/混合液含有0.1M的NaOH 和 0.1M 的 Na4P2O7。
[0017]所述的还原能力测定方法，其中，步骤I中的NaOH和Na4P2O7混合液是以固液比lg: 1ml加入有机废弃物中。
[0018]所述的还原能力测定方法，其中，步骤I和步骤6中的HCl为6M的HCl。
[0019]所述的还原能力测定方法，其中，步骤2中的LB液体培养基经过高温灭菌处理。
[0020]所述的还原能力测定方法，其中，步骤4中的无机培养液的组成为1500mg/L的NH4Cl、600mg/L 的 NaH2PO4、100mg/L CaCl2、100mg/L 的 KCl、2mg/L 的 MgCl2、5mg/L 的 MnCl2、lmg/L NaMoO4，配置完后过0.22 μ m滤膜进行灭菌处理。
[0021]所述的还原能力测定方法，其中，步骤5中菌悬液加入粗胡敏酸溶液中的混合体积比为1:1。
[0022]所述的还原能力测定方法，其中，步骤5中柠檬酸铁的浓度为ImM，乳酸钠溶液的浓度为20mM。
[0023]所述的还原能力测定方法，其中，步骤7中反应混合液中Fe2+的含量测定方法如下:将反应混合液过0.22 μ m滤膜后，加入5ml邻菲啰啉溶液，摇匀并用无菌水定容至25ml，静置30min后，测定其510nm的吸光度值，并与FeSO4标准曲线对比，计算其中Fe 2+的含量。
[0024]本发明可以有效的将胡敏酸中不能稳定进行电子转移的组分降解去除，留下能稳定进行电子转移的部分，并测定胡敏酸中能稳定进行还原能力的胡敏酸的还原能力。
[0025]本发明对于堆肥产品质量评价、堆肥技术优化以及拓展堆肥产品应用均具有指导意义。
[0026]本发明操作便捷、筛选所得胡敏酸组分纯度高、筛选效果好。
【附图说明】
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[0027]图1是有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取及其还原能力测定流程图。
[0028]图2是厨余垃圾堆肥胡敏酸组分电子转移能力变化图；其中a为餐厨堆肥粗提胡敏酸组分电子转移能力变化图，b为餐厨堆肥稳定电子转移能力胡敏酸组分电子转移能力
变化图。【具体实施方式】
[0029]本发明的有机废弃物中具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力测定方法中包括具有稳定还原能力胡敏酸的提取，主要步骤为:
[0030]I)有机废弃物中粗胡敏酸组分的提取:将NaOH和Na4P2O/混合液以固液比lg: 1ml加入有机废弃物中，室温下避光震荡16?24h，11000r/min离心1min后取上清液，随即用6M的HCl将上清液酸化至pH = 2，静置12h，11000r/min离心lOmin，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀，直至洗出液无cr检出，用磷酸氢二钠缓冲液将胡敏酸沉淀溶解。其中的NaOH和Na4P2O/混合液含有0.1M的NaOH和0.1M的Na 4P207。
[0031]2)MR-1菌接种与扩繁培养:在超净工作台下接种胞外呼吸细菌MR-1至经过高温灭菌处理的LB液体培养基中，接种后避光摇床培养12?24h。
[0032]3)菌悬液离心:将培养好的菌悬液12000r/min下离心lOmin，弃去上清液，保留菌体沉淀。
[0033]4)菌体重悬:往菌体沉淀中加入无机培养液，在漩涡振荡器中将菌体重悬，得菌悬液。无机培养液的组成为 1500mg/L 的 NH4Cl、600mg/L 的 NaH2P04、100mg/L CaCl2UOOmg/L 的 KCl、2mg/L 的 MgCl2、5mg/L 的 MnCl2、lmg/L NaMoO4,配置完后过 0.22 μ m 滤膜进行灭菌处理。
[0034]5)粗胡敏酸组分的纯化:将菌悬液加入步骤I提取出的粗胡敏酸溶液中，两者混合的体积比为1:1，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液，柠檬酸铁的浓度为ImM，乳酸钠溶液的浓度为20mM。随后往混合液中充氮气15?30min，充氮结束后将盖上盖子并采用封口膜将瓶盖密封，避光摇床震荡培养24h，得反应液。
[0035]6)具有稳定还原能力胡敏酸组分的提取与纯化:将反应液过0.45 μ m滤膜，收集滤液，用6M的HCl将反应液pH调至pH = 2，静置12h后，12000r/min离心lOmin，弃上清液，用超纯水冲洗胡敏酸沉淀直至洗液不再有Cl—检出后，用磷酸二氢钠缓冲液溶解胡敏酸沉淀，得胡敏酸溶液。
[0036]7)胡敏酸稳定还原能力的测定:往步骤6所得胡敏酸溶液加入步骤4中的菌悬液，同时加入柠檬酸铁和乳酸钠溶液。随后往混合液中充氮气15?30min，充氮结束后立即封盖并用封口膜将瓶盖密封，避光摇床震荡培养12h，得反应混合液，取反应混合液中的一部分，采用邻菲啰啉法测定混合液中Fe2+的含量，根据加入的Fe 3+量与反应后生成的Fe 2+量计算具有稳定还原能力胡敏酸的还原能力。
[0037]反应混合液中Fe2+的含量测定方法如下:将反应混合液过0.22 μ m滤膜后，加入5ml邻菲啰啉溶液，摇匀并用无菌水定容至25ml，静置30min后，测定其510nm的吸光度值，并与FeS04#准曲线对比，计算其中Fe 2+的含量。
[0038]8)胡敏酸稳定还原能力的验