快速检测大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸 及制备方法。
【背景技术】
[0002] 大豆中蛋白质含量丰富，一般为35°/『38%，氨基酸组成平衡，且富含不饱和脂肪酸， 是人体和动物体重要的植物蛋白和植物油来源。由于其种植面积广，产量大，长久以来一 直被广泛应用于食品和饲料的加工原料，对于人类健康和动物营养具有极高的使用价值。 然而大豆中也含有多种抗营养因子，这些抗营养因子在很大程度上影响了大豆的开发与利 用。
[0003] 大豆胰蛋白酶抑制因子（Kunitz trypsin inhibitor，KTI)是大豆主要抗营养因 子之一，属于多肽类或蛋白质，分子量在7975~21500D之间，大约由72~197个氨基酸残基组 成，约占大豆蛋白的6%。KTI是由Kunitz于1945年首次从大豆中分离出来的，其分子量为 20~25kD，由181个氨基酸和少量的半胱氨酸形成的2个二硫键组成。KTI能抑制人和动物 肠道内胰腺分泌的胰蛋白酶的活性，降低蛋白质的消化吸收，引起胰腺增生和肥大，导致生 长停滞，诱发过敏反应等问题。因此，人们在生产实践中探索各种方法将大豆制品进行适当 的加工处理，以减少或消除大豆胰蛋白酶抑制因子，但这些方法都不能完全消除其影响。所 以建立有效、准确的检测方法来检测食品及饲料中KTI的含量显得尤为重要。
[0004] 免疫层析试纸检测方法具有成本低、快速、便携且易操作等优点，可以用于大批量 样品的定性与定量检测，在准确性和灵敏度上也能够满足要求，该法分析过程简单，用作 KTI的检测有独特优势，是需要优先发展的检测技术。但目前仍没有关于KTI免疫层析试纸 检测方法的报道，所以该方法将会成为大豆胰蛋白酶抑制因子检测方法的一个发展方向。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，提供一种特异、灵敏、简便、 安全、快速检测KTI的免疫层析试纸及其制备方法。
[0006] 本发明的技术方案： 一种快速检测KTI的胶体金免疫层析试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固 定在吸附层上，吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫。在纤维素膜设 有用KTI兔源多克隆抗体溶液喷点的检测线以及用羊抗小鼠 IgG抗体或兔抗小鼠 IgG抗体 溶液喷点的质控线；所述结合垫吸附有胶体金纳米颗粒标记的KTI鼠源单克隆抗体。
[0007] 所述支撑层用不吸水的韧性材料制成；样品垫用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙 烯膜或聚酯膜制成；结合垫用玻璃纤维棉、聚酯膜、醋酸纤维或尼龙膜制成；纤维素膜用硝 酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸或滤油纸制成。纤维素膜 上的隐形检测线和隐形质控线为平行排列的" I I "直线式，或为其他类似印记。
[0008] 快速检测KTI的胶体金免疫层析试纸的制备方法：包括用胶体金纳米颗粒标记的 KTI鼠源单克隆抗体(金标单抗)制备结合垫，用KTI兔源多克隆抗体溶液喷点隐形检测线， 用羊抗小鼠 IgG抗体或兔抗小鼠 IgG抗体溶液喷点隐形质控线，然后在支撑层上黏贴样品 垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫。在所述样品垫、结合垫及吸水垫上覆盖有保护膜，在样品垫 与结合垫交界处对应的保护膜上喷点有样品标记线，最后加上保护层。
[0009] 该试纸利用了双抗体夹心检测抗原的原理，当试纸测试端插入待测样品溶液后， 待测溶液通过虹吸作用带动待测KTI及结合垫中的金标单抗一起向纤维素膜扩散，并最终 渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测KTI可先与金标单抗相结合，进而与纤维素 膜上喷点的兔源多克隆抗体检测线结合，金标抗体和兔源多克隆抗体分别与样品中被检测 的KTI分子上的不同抗原决定簇结合，KTI被夹在金标单抗和兔源多克隆抗体之间，形成金 标单抗-抗原-兔源多抗复合物，即双抗体夹心模式，显示红色检测印记" I ";纤维素膜上 喷点的羊或兔抗小鼠 IgG抗体质控线也可与金标抗体结合，形成红色质控印记" I "，即两 条红色印记" I I "表示为阳性；反之样品溶液中无 KTI时，则不能与金标抗体结合，同样也 不能与纤维素膜上喷点的兔源多克隆抗体检测线结合，不显示红色检测印记，而纤维素膜 上喷点的羊或兔抗小鼠 IgG抗体质控线可与金标抗体结合，显示红色质控线印记" I "，形 成一条红色印记" I "表示为阴性。无论结果为阳性还是阴性，都会显示红色质控印记，若 不显示则表示试纸失效。
[0010] 本发明的积极有益效果： (1)特异性强，灵敏度高。本发明试纸以双抗体夹心原理为基础制备而成，两种抗体分 别为胶体金纳米颗粒标记的鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体。金标抗体中金颗粒与抗 体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的 特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。试验表明，该试纸具有较高的灵敏度，可 检测100ng/mL的微量KTI ;用该试纸分别检测高浓度的glycinin、β-conglycinin、大豆 Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素，浓度为20mg/mL，结果检测线均不显色，说 明该试纸与这几种大豆蛋白均没有交叉反应，具有良好的特异性。
[0011] (2)简便、快速。使用本发明试纸，无需其他任何试剂和仪器，可现场操作。只需将 试纸插入被检样品液中，IOmin后即可判定检测结果。
[0012] (3)结果显示形象、直观、准确。本发明试纸以显示红色印记" I Γ和" Γ (或类 似性状)作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示两条红色印记" I I "（检测线和 质控线)，表示被检样品中含有KTI;显示一条红色印记" I "(质控线)，表示被检样品中不含 KTI。此结果可用肉眼直接观测，判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性 等人为误判。
[0013] (6)节省费用。适用于进行现场检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。
[0014] (7)适用范围广，便于推广应用。本发明实现了基于双抗体夹心的原理在快速检测 KTI胶体金免疫层析试纸中的应用，该试纸操作简便，能满足不同层次人员的需要，包括海 关检疫、卫生检疫、质量监测、农畜产品生产企业和饲料加工企业等。本发明在保障食品安 全、保护对于大豆过敏的消费者健康以及保障畜禽饲料安全等方面具有极其重要的意义， 具有明显的经济效益和社会效益。
[0015] (8)本发明制备的单克隆抗体的亲和常数达到109L/mol，并且单克隆抗体的特异 性较好，采用间接竞争ELISA测定与其他大豆蛋白的交叉反应率进行鉴定，这几种大豆蛋 白竞争物包括大豆球蛋白、β -伴大豆球蛋白、大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子和大豆 凝集素，以KTI的半数抑制浓度（IC5tl)与各竞争物的IC5tl的百分比作为交叉反应率，单克隆 抗体与这几种大豆蛋白竞争物之间基本没有交叉反应，结果表明其对于KTI具有良好的特 异性。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的免疫层析试纸的结构示意图。
[0017] 图2为本发明的免疫层析试纸的俯视结构示意图。
[0018] 图中，1为支撑层，2为样品垫，3为结合垫，4为纤维素膜，5为吸水垫，6为检测线， 7为质控线，8-1为测试端保护膜，8-2为手柄端保护膜，9为样品标记线。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例是为了更好的解释本发明，但并不表示对本发明的特别限定，如果没 有特别说明，其中的百分含量均可理解为重量百分