用于分析含氮化合物的新型茚三酮试剂的制作方法

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用于分析含氮化合物的新型茚三酮试剂的制作方法
【专利说明】用于分析含氮化合物的新型茚三酮试剂
[0001]本发明涉及一种用于分析含氮化合物如氨基酸等的新型试剂及其使用方法。
[0002]氨基酸是形成蛋白质的组分,蛋白质又在许多生物学过程中起关键作用。在许多情况下,在个体中存在或不存在特定氨基酸可严重影响其健康。例如,患遗传代谢紊乱苯丙酮尿症的个体不能代谢苯丙氨酸;苯丙氨酸的累积会严重影响其大脑发育。因此,用于检测游离氨基酸或者测定蛋白质的氨基酸组成的方法对正确的诊断和疾病管控是至关重要的。类似地,该类方法对商业药品、食品和食物的分析以及蛋白质和酶研宄及开发是重要的。更一般地,含氮化合物的检测和识别用于宽范围的学科中,包括农业、生物化学、临床、环境、食品、法医、组织化学、微生物、医疗、营养、植物和蛋白质科学。
[0003]目前,通常使用自动氨基酸分析仪检测游离或水解释放的氨基酸。Moore、Stein和Spackman在二十世纪五十年代开发了第一种自动化氨基酸分析方法(Spackman DH, SteinWH和 Moore S., Automatic recording apparatus for use in the chromatography ofamino acids, Anal Chem, 1958, 30:1190-1206)。该多级方法包括借助离子交换液相色谱法分离氨基酸。由试剂池泵送茚三酮试剂,与离子交换柱的洗脱液混合,并使其通过钢或塑料反应盘管,加热至反应所需的温度。茚三酮与所有氨基酸和相关的胺化合物反应,从而形成高度显色的反应产物。Ruhemann紫由伯胺和伯氨基酸形成,且可通过570nm波长下的光吸收测定。其它显色反应产物、特别是黄色反应产物由仲胺和许多仲氨基酸形成。这些反应产物可通过其在440nm波长下的光吸收测定。所述显色反应产物的强度根据氨基酸浓度变化。
[0004]使氨基酸反应产物通过光度计,其中在合适的波长、特别是在570nm和440nm下检测染料配合物吸收的光。可通过色谱法确定不同氨基酸的存在。各种氨基酸的识别建立在其迀移特性以及因此其在色谱图的位置的基础上。氨基酸的浓度通过在光度计中借助特定波长下的吸光度检测的显色产物的强度确定。因此,该方法可用于定性和定量确定测试样品中存在何种氨基酸以及各自的相对浓度。
[0005]茚三酮和氨基酸或胺之间的显色反应在室温下非常缓慢。它在高温下显著更快,但仍消耗很多分钟,即使是在130°C和更高的温度下液如此。为了保持良好的色谱性能,所述显色反应必须在约I分钟或更短的时间内进行。为了获得该性能,发现还原茚三酮(即茚三酮的还原形式)是茚三酮试剂发挥作用所必需的,且提供了可接受的反应速率。为了解释还原茚三酮在高温下加速形成显色产物的能力,已提出了许多原因和机理。一种看法是还原茚三酮起一种反应中间体的稳定剂的作用。因此,它被视为促进剂而非催化剂。
[0006]术语“茚三酮试剂”是指包含用于氨基酸分析仪中所必需的所有成分的溶液。因此,茚三酮试剂包含还原茚三酮、茚三酮和必需的缓冲剂及溶剂。茚三酮试剂可通过将单独的还原茚三酮溶液添加至茚三酮溶液中形成。尽管优选提供一种包含氨基酸分析所必需的所有成分的溶液,然而会导致茚三酮试剂具有不可接受的低贮存寿命。替代地,还原茚三酮可通过将还原剂添加至茚三酮溶液中由此将一部分茚三酮还原成还原茚三酮而原位制备。还原茚三酮的原位形成在强氧化剂存在下或多或少地瞬时发生。然而,这两种方法均需要用户在将茚三酮试剂准备用于氨基酸分析之前,将单独的茚三酮溶液与单独的还原茚三酮溶液或者合适的还原剂混合。
[0007]最近,生产商的优选做法是提供两个瓶,其中一个含有还原茚三酮在有机溶剂中的溶液,另一个含有茚三酮溶液、含水缓冲剂和额外有机溶剂,两个瓶均在惰性气氛下紧密密封。然后,在用于氨基酸分析仪之前不久或者在恰好使用前,将瓶中的内容物混合,从而形成茚三酮试剂。
[0008]遗憾的是,还原茚三酮是一种非常难处理的试剂。它在空气存在下特别不稳定,氧气会将还原茚三酮快速氧化回茚三酮。仅需相对较少量的空气就严重贫化还原茚三酮,由此显著降低显色敏感度。如果未从所述试剂中严格排除空气,则还原茚三酮的浓度会缓慢降低,直至在色谱分析的时间框架内不发生显色反应。
[0009]因此,必须将含还原茚三酮的茚三酮试剂在周围空气中的暴露保持至绝对最低,因为即使极少的痕量氧气暴露也会导致还原茚三酮活性的稳步损失。在茚三酮试剂的制备和使用期间均可使用惰性气氛,通常为氮气。可知晓的是,该要求导致需要复杂的设备和处理程序,以确保还原茚三酮活性在其使用之前和/或期间不以不可接受的速率劣化。尽管使用了这些预防措施,然而含还原茚三酮的茚三酮试剂通常具有不长于I个月的贮存期限。
[0010]此外,还原茚三酮不溶于完全水性的介质中。然而,还原茚三酮可溶于许多有机溶剂中。因此,通常在所述试剂中添加相对较高比例的有机溶剂以降低还原茚三酮在储存和使用期间的沉淀可能性。的确,通常使用高达75体积%的有机溶剂含量。所述溶剂也可包含两种或更多种不同类型溶剂的组合以确保还原茚三酮充分溶解。用于该目的的有机溶剂通常包括二甲亚砜(DMSO)、甲基溶纤剂、乙二醇和环丁砜。更进一步地,如果所用的有机溶剂不足或者还原茚三酮的浓度过高,则在静置时可发生沉淀或者累积在色谱装置中,从而堵塞管道。
[0011]鉴于上述与使用还原茚三酮有关的困难,已提出了使用典型茚三酮试剂进行氨基酸分析的替代技术和设备。例如,US3,632,496公开了一种试剂产生器,其由具有从其中穿过的通道的长外壳形成,其包括位于一端的入口以接受试剂和位于另一端的出口以排出活化的试剂。所述通道由对茚三酮还原形成活化试剂具有催化活性的金属材料表面限定。以此方式,呈其稳态的茚三酮可在一个囊中储存和活化。
[0012]US4, 359,323涉及一种用于胺的液相色谱分析系统。所述系统由色谱柱、反应柱和再循环流动相以再利用的环路构成。该系统的主要和最显著的特征是液态流动相由如下组合构成:洗脱液以及与胺反应以产生可光度检测的化合物的物质。因此,该方法仅需一个泵进行完整操作。尽管泵送系统具有降低的复杂度,然而还原茚三酮在混合物中的存在仍带来了与目前商购试剂相同的不稳定性和空气敏感性问题。
[0013]除上述内容之外,已评价了许多还原剂对用于氨基酸分析所必需的试剂的适用性。茚三酮的还原剂优选在所述试剂溶液中高度可溶、对茚三酮具有优异的还原性能、不形成显色副产物、对设备呈惰性、稳定且易于处理。然而,正如下文更详细论述的那样,现有还原剂并不具有全部这些特性,因此会以一种或多种方式以显著程度干扰氨基酸分析的敏感度和精度。
[0014]在持续开发茚三酮试剂的过程中,大量关注使用强还原剂原位产生还原茚三酮。Moore、Stein和Spackman的原创方法使用氯化亚锡作为还原剂。然而,产生足以导致合理快速反应的还原茚三酮所需的氯化亚锡量会导致氢氧化锡化合物最终沉淀,这又会污染和堵塞流动管道。因此,很快放弃使用氯化亚锡,并研宄了其它还原剂如氰化物、亚钛盐、硼氢化物和抗坏血酸。氰化物由于毒性问题且缺乏必要的稳定性而无法商业应用。针对硼氢化钠和抗坏血酸还原剂进行了更认真的研宄。
[0015]例如,US3,778,230公开了用于通过液相色谱法自动分析氨基酸的显色溶液,其中使用抗坏血酸作为还原剂。在所述方法中,使抗坏血酸与茚三酮在甲基溶纤剂存在下反应,从而形成还原茚三酮。发现抗坏血酸具有若干优点如提高的溶解性、强还原性能和显色敏感度。此外,与常规还原剂如氯化亚锡相比,抗坏血酸在劣化后易于再生。
[0016]尽管具有这些优点,US3, 778,230中所公开的包含抗坏血酸作为还原剂的茚三酮试剂易氧化。必须首先制备茚三酮试剂,通常在惰性容器中在环境温度下。其结果是,需要繁琐且耗时的程序以将还原茚三酮的氧化风险降至最低。此外,在该方法中在到达加热反应盘管之前将分离的氨基酸引入茚三酮试剂中时,耗费大量的时间,由此使得色谱中记录的结果失真。此外,在此期间,茚三酮试剂可能暴露于扩散至分析设备中的氧气中。实际上,US3, 778,230承认包含抗坏血酸的茚三酮试剂的劣化特性仅与Moore、Stein和Spackman的包含氯化亚锡(即15天)的相当。在由于空气氧化劣化之后,必须重新添加抗坏血酸才能恢复显色能力。由于氯化亚锡的低溶解性,使用常规Moore、Stein和Spackman方法的类似途径是不可能的。
[0017]使用抗坏血酸作为还原剂的最显著缺点之一可能是已知仅在加热下就形成褐色分解物质。US3,778,230提出抗坏血酸与茚三酮反应的反应产物不是褐色的。然而,存在使用抗坏血酸作为还原剂会导致由于抗坏血酸的热分解而形成显色副产物由此不利影响色谱记录结果的精度的高风险。
[0018]在另一实例中,US4,274,833公开了一种茚三酮试剂,其包含还原剂(硼氢化钠或氯化亚锡)或还原茚三酮本身,以及水溶混性有机溶剂环丁砜。其指出使用环丁砜作为增溶剂具有许多优点。特别地,环丁砜非常好地溶解还原茚三酮和茚三酮,且不与任何溶液组分反应。因此,所述试剂长时间稳定而不发生已知会导致流动管线堵塞的沉淀。据称包含还原茚三酮的茚三酮试剂的寿命为至少3个月。然而,正如US3,778,230情况下那样,必须首先制备茚三酮试剂,通常在惰性容器中在环境温度下。如上所述,这要求繁琐且耗时的程序以使还原茚三酮的氧化风险降至最低。
[0019]自从Moore、Stein和Spackman发现需要还原節三酮的節三酮基分析以来,在最近60年内很少变化。相反,该方法仍是目前最普遍使用的技术。尽管自那时起已通过使用不同还原剂和/或溶剂对该方法进行了改进,其仍具有缺点,包括上文着重强调的易氧化和在水溶液中的低溶解性。
[0020]尽管已在寻找替代还原剂方面进行了相当的研宄,然而生产商通常会回归到提供还原茚三酮和茚三酮的单独溶液。生产商通常提供两个瓶,其中第一个瓶中含有还原茚三酮在有机溶剂中的溶液,第二个瓶含有茚三酮、含水缓冲剂和额外有机溶剂的溶液;这两个瓶均在惰性气氛下紧密密封。然后在用于氨基酸分析仪之前,将所述瓶混合以形成茚三酮试剂。
[0021]大多数生产商声称在混合前具有约12个月的最高贮存期限,且在混合后具有2-3个月的最高贮存期限。然而,一旦与分析仪器相连,则混合试剂的寿命甚至更低,且可显著地短于I个月。
[0022]Hitachi似乎是提供用于制备还原茚三酮的还原剂、特别是硼氢化钠的唯一主要生产商。硼氢化钠不易处理,且为特别不稳定的还原剂。仅在保存于非水性溶剂中才能获得合理的稳定性。使用硼氢化钠作为还原剂的主要优点是不形成不希望的显色产物或沉淀。然而,在生产期间仍需要两个瓶,但组成和混合方式明显不同于上述方法。一个瓶含
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