一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境毒理与生物医学，特别是一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] 代谢物分析是一种重要的生物体征和毒理指标的分析方法，通过对生物体内代谢 物进行定性或定量的分析可以在生物体内发生的一系列变化以及发生变化的节点，有助于 生物毒性的判断以及环境污染等情况的分析。
[0003] 本发明所使用的受试生物为斑马鱼。斑马鱼具有体型小、易于养殖繁殖以及成本 低等优点，在生态毒理等领域的使用十分广泛。且斑马鱼在遗传、生理和药理反应方面与人 类存在高度的相似性，因此可作为良好的模式动物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应 用，该提取方法工艺简单、易于实施，用于纳米材料对斑马鱼低浓度暴露的毒性实验，相对 于其他的毒性检测方法更灵敏和简便的得到更多可用的数据。
[0005] 本发明的技术方案：
[0006] -种斑马鱼代谢物的提取方法，步骤如下：
[0007] 1)将斑马鱼样品用生理盐水冲洗干净后准确称重，然后迅速浸没于液氮中保存备 用；
[0008] 2)将上述斑马鱼样品置于盛有液氮的研钵中在_80°C温度下研磨5分钟至斑马鱼 组织变成匀质浆体；
[0009] 3)将上述浆体状斑马鱼样品加入-20°c预冷的提取液中，在40°C温度下微波萃取 30分钟，微波萃取功率为（样品罐数+2) X 100W，离心后收集第一次上清液，然后在固体残 留物中再加入相同量的上述_20°C的提取液，继续在40°C温度下微波萃取30分钟，离心后 收集第二次上清液；
[0010] 4)将第一次上清液与第二次上清液混合，在混合液中加入灭菌去离子水，4000rpm 下离心5分钟，静置5分钟后溶液分层，上层溶液是甲醇/水相，下层溶液为氯仿相，两相分 离后将氯仿相用氮气吹干，然后将甲醇/水相转移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；
[0011] 5)将上述混合溶液放入冷冻干燥机内以-30°C - -50°C真空干燥后，采用两步法 进行衍生化：首先加入浓度为20mg/mL的甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液，密封后涡旋1分钟， 后将其在3000rpm下离心1分钟，再在30°C下温浴90分钟，然后加入硅烷化试剂N-甲 基-N-(三甲基硅烷）-三氟乙酰胺（MSTFA)，37°C下温浴30分钟，得到斑马鱼代谢物衍生化 样品并转移到适合GC-MS分析的内衬管中保存。
[0012] 所述步骤3)提取液为甲醇、氯仿与水的混合液，混合液中甲醇、氯仿与水的 体积比为2. 5:1:1，其中甲醇、氯仿与水均为色谱纯；斑马鱼样品与提取液的用量比为 0? 3-0. 5g:15mL〇
[0013] 所述步骤4)中斑马鱼样品与灭菌去离子水的用量比为0. 3-0. 5g :500 y L。
[0014] 所述步骤5)中斑马鱼样品与甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液的用量比为0. 3-0. 5g: 50 y L，斑马鱼样品与硅烷化试剂的用量比为0. 3-0. 5g :80 y L。
[0015] 一种所述斑马鱼代谢物的提取方法的应用，用于斑马鱼纳米毒性检测。
[0016] 本发明的优点是：该斑马鱼代谢物的提取和分析方法简单、准确，易于实施，用于 斑马鱼暴露于低浓度纳米材料实验，可使斑马鱼毒性检测的灵敏性提高。
【附图说明】
[0017] 图1是同一批次染毒的斑马鱼成鱼的总超氧化物歧化酶活性对比图。
[0018] 图2是同一批次染毒的斑马鱼成鱼的丙二醛含量对比图。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 :
[0020] 一种斑马鱼代谢物的提取方法，步骤如下：
[0021] 1)将斑马鱼样品用生理盐水冲洗干净后准确称重，然后迅速浸没于液氮中保存备 用；
[0022] 2)将上述斑马鱼样品置于盛有液氮的研钵中在_80°C温度下研磨5分钟至斑马鱼 组织变成匀质浆体；
[0023] 3)将上述浆体状斑马鱼样品加入-20°C预冷的提取液中，提取液提取液为甲醇、 氯仿与水的混合液，混合液中甲醇、氯仿与水的体积比为2. 5:1: 1，其中甲醇、氯仿与水均为 色谱纯，斑马鱼样品与提取液的用量比为0. 3g :15mL，在40°C温度下微波萃取30分钟，微波 萃取功率为（样品罐数+2) X 100W，离心后收集第一次上清液，然后在固体残留物中再加入 相同量的上述-20°C的提取混合液，继续在40°C温度下微波萃取30分钟，离心后收集第二 次上清液；
[0024] 4)将第一次上清液与第二次上清液混合，在混合液中加入灭菌去离子水，斑马鱼 样品与灭菌去离子水的用量比为0. 3g :500 y L，4000rpm下离心5分钟，静置5分钟后溶液 分层，上层溶液是甲醇/水相，下层溶液为氯仿相，两相分离后将氯仿相用氮气吹干，然后 将甲醇/水相转移至已干燥的氯仿相中，得到混合溶液；
[0025] 5)将上述混合溶液放入冷冻干燥机内以-30°C - -50°C真空干燥后，采用两步法 进行衍生化：首先加入浓度为20mg/mL的甲氧氨基盐酸盐-吡啶溶液，斑马鱼样品与甲氧氨 基盐酸盐-吡啶溶液的用量比为0. 3g :50 y L，密封后涡旋1分钟，后将其在3000rpm下离 心1分钟，再在30°C下温浴90分钟，然后加入硅烷化试剂N-甲基-N-(三甲基硅烷）-三氟 乙酰胺（MSTFA)，斑马鱼样品与硅烷化试剂的用量比为0. 3g :80 y L，37°C下温浴30分钟，得 到斑马鱼代谢物衍生化样品并转移到适合GC-MS分析的内衬管中保存。
[0026] 以上斑马鱼样品设为第一组样品。
[0027] 对比实验：
[0028] 1)第二组样品
[0029]该组斑马鱼代谢物的提取方法，步骤与第一组样品基本相同，不同之处在于：将步 骤3)中的微波萃取改变为超声萃取，超声功率为100W。
[0030] 2)第三组样品
[0031] 该组斑马鱼代谢物的提取方法，步骤与第一组样品基本相同，不同之处在于：将步 骤3)中的提取混合液改变为色谱纯乙醇。
[0032] 3)第四组样品
[0033] 该组斑马鱼代谢物的提取方法，步骤与第一组样品基本相同，不同之处在于：
[0034] 将步骤3)中的提取混合液改变为色谱纯乙醇，同时微波萃取改变为超声萃取，超 声功率为100W。
[0035] 以上四组样品的分析：
[0036] 分析仪器为安捷伦气相色谱串联质谱。参数设置如下：
[0037] 气相色谱进样参数为：采用自动进样器进样，进样量1 UL，进样口温度230°C、斑 马鱼成鱼分流进样比例为1:10,幼鱼不分流、载气为氦气，流速2mL/min。
[0038] 气相色谱参数为：MDN-35毛