酵母硒总硒、无机硒、有机硒含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酵母硒中硒含量，尤其是有机硒含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 1974年，美国食品药品监督管理局（FDA)开始允许在畜禽和猪饲料中添加硒。至 此，无机硒和有机硒的研宄与应用进入了更加开阔的领域（Ullrey，1992)。获得有机硒最经 济的来源之一是通过酵母富集无机硒（Neve，1998)。酵母能够吸收碳、氮、磷、硫和矿物质以 及微量元素，因为硒与硫是同族元素，在物理及化学特性上具有相似性，使得其在酵母细胞 生物合成反应中取代硫（Jian Zheng，2003)，富硒酵三母就是在酵母培养过程中加入亚硒 酸钠等形式的无机硒，使之转化为有机硒形式并在酵母中富集而生产出的一种微生物发 酵产物(蒋守群，2006)。富硒酵母中所能达到的最大硒量约为3000 mg/kg (Demirci，1999; Gassner，1999)，而商业富硒酵母的含硒量一般为500~2000 mg/kg ( 0? 05%~0? 20%)( Schrauzer, 2006)。我国的饲料添加剂品种目录（2013)中将亚硒酸钠和酵母硒作为矿物 元素饲料添加剂用于养殖动物补硒剂。亚硒酸钠作为硒添加剂，硒源丰富，价格较低，但是 存在生物有效性低、中毒量与需要量之间范围小、毒性大、易污染环境等缺陷，因而被严格 限制其使用量(刘恒，2014)，欧盟等一些国家和地区已经限制或禁止使用亚硒酸钠作为硒 的营养补充剂(刘娜，2010)，例如瑞典已限制其在乳猪料中使用。而日本则禁止在动物饲料 中添加亚硒酸钠(沈银书，2008)。富硒酵母作为有机硒饲料添加剂，具有硒利用率高、毒性 低、对环境污染小等优点，其添加效果大大优于亚硒酸钠，因而受到广泛的关注，并呈现逐 渐取代亚硒酸钠在饲料中添加的趋势(沈银书，2008)。
[0003]目前，酵母硒的有机硒含量测定方法还没有形成国家标准。常用的总硒的含量 测定是基于分光光度法分析硒与有机试剂间形成的苤硒脑衍生物，如3,3-二氨基联苯 胺（Porcella，1991)、双硫腙（0 &11^611，1980)、邻苯二胺(周建波，1993)、2,3-二氨基萘 (Juana, 2004)、6_ 氨基-1-萘酷 _3_ 横酸（Ramachandran，1993 ;Manish，1994)、2, 3-二 氨基-1，4_二溴代萘（]〇1^1188011，1995);氢化物发生-原子吸收光谱法（1&188〇116165〇1， 1991 ;Ragnar，1987)和原子荧光光谱法（高建忠，2006 ;王世成，2013)，也被报道用于硒 的测定，氢化物-原子荧光光谱法成为我国国家标准食品中硒的测定法的标准（GB/T 5009.93-2010)。
[0004]对于有机硒样品中总硒的测定，我国国家标准食品中硒的测定法（GB/T 5009. 93-2010)和饲料中硒的测定（GB/T 13883-2008)中，将试样置于消化瓶或烧杯中加入 20 mL混合酸，再用电热板加热煮沸消化，后用用氨水或盐酸调至淡红橙色（pHl. 5~2. 0)，并 用甲酚红溶液来做指示剂。上述方法中，20 ml混合酸带来环境污染和资源浪费；消化是否 完成则以观察消化过程中产生的浓白烟来判定，由于没有一个明确的指标，大多数情况下 都是凭借经验做出判断，使判定结果很难精确，受主观因素影响很大；硒在上述消化过程中 很容易挥发损失，使测定结果难于保证；另外由于样品消化液本底的干扰，指示剂对颜色变 化很难判断，同时指示剂的加入也会带来干扰的可能。
[0005] 国家标准方法中尚无无机硒的测定方法，文献报道先用缓冲盐或酸来提取(高建 忠，2006)，再采取总硒的测定方法来进行测定；也有报道为了测定硒酵母中有机硒的含 量，首先建立了一种无机硒和有机硒的鉴别方法，再采用透析处理法使硒酵母中的无机 硒和有机硒得以分离。上述提取方法耗时较长且十分繁琐。
【发明内容】
[0006] 针对现有硒检测技术的不足，本发明提供一种酵母硒总硒、无机硒、有机硒含量的 测定方法。
[0007] -种酵母硒总硒含量的测定方法，称取50 mg的酵母硒于100 mL的圆底烧瓶中， 加入1 mL的质量百分比为69%的浓硝酸，再加入2 mL质量百分比为70 %~72%的高氯酸， 置于沸水浴中磁力搅拌lh;结束冷却后，加入8. 4 mL浓度为6 mol/L的HCL，再置沸水浴中 反应10 min，将上述溶液转移到容量瓶中，并用水定容至100mL，取出2.0 mL加入至锥形瓶 中，再加入30~40mL的水，调节pH至1. 5~2. 0,接着加入3 mL EDTA混合液摇匀，后加入 3 mL DAN (2, 3-二氨基萘）溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min，取出冷却至室温，然后全部 转移到125 mL分液漏斗中，加10 mL环己烧振荡2.0 min，静置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm测定环己烷层的荧光强度，从而得到酵母硒中总硒含量。
[0008] 所述的调节pH至1. 7~1. 9。
[0009] -种酵母硒无机硒含量的测定方法，称取25 mg的酵母硒于100 mL的圆底烧 瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液，置于沸水浴中磁力搅拌10 min，冷却后调节pH至 1.5~2.0,接着加入3 mL EDTA混合液摇匀，后加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min ;取出冷却至室温，全部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烷振荡2. 0 min，静 置分层后，用激发光波长376 nm、发射光波长520 nm测定环己烷层的荧光强度，从而得到 酵母硒中的无机硒含量。
[0010] 一种酵母硒有机硒含量的测定方法，总硒含量根据所述方法测定，无机硒含量根 据所述方法测定，相差得到有机硒的含量。
[0011] 本发明的有益效果 本发明得到了有机硒含量测定方法：对总硒的测定使用了 3 mL混合酸，大大减少了混 合酸的用量；对总硒和无机硒含量的测定避免了使用电热板加热煮沸消化，消解和提取在 加盖的圆底烧瓶中水浴进行，该操作可以避免强氧化还原性酸对实验室环境的污染，同时 可防止硒的挥发损失，得到较高回收率，同时有效提高样品前处理的可操作性和准确性；取 消了甲酚红指示剂的使用，用pH计来监测酸性环境，避免了样品对指示剂颜色变化的判断 造成干扰，同时也减少了指示剂对待测液的干扰的可能性；通过测定环己烷萃取层的荧光 值可计算硒的含量，避免了使用成本较高的原子荧光分光谱仪的使用，使普通实验室能够 用该方法完成硒样品中有机硒含量的检测；总硒和无机硒的测定时间大大缩短，总硒的消 化和无机硒的提取同时在约一个小时可以完成。
【附图说明】
[0012] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进一步详细的说明； 图1为硒标准溶液的标准曲线及线性方程。
【具体实施方式】
[0013] 方法原理 样品中的硒可能以不同的化学形式存在，包括无机硒和有机硒。样品经酸加热消化后， 在盐酸介质中，将试样中的硒统一还原成四价硒，四价硒在微酸性条件下与2,3_二氨基萘 (DAN)生成苤硒脑络生物，用环己烷萃取。用荧光光度计在激发波长为376 nm、发射波长为 520 nm条件下测定荧光强度，从而计算出样品中的硒含量。
[0014] 总硒含量测定方法，准确称取50 mg左右的酵母硒于100 mL的具塞圆底烧瓶中， 加入1 mL的浓硝酸（69%)，再加入2 mL的高氯酸（70 %~72%)，再置沸水浴中磁力搅拌lh; 冷却后加入8.4 mL HCL(盐酸浓度为6 mol/L)，再置沸水浴中反应10 min。我国国家标准 食品中硒的测定法（GB/T 5009. 93-2010)和饲料中硒的测定（GB/T 13883-2008)将试样置 于消化瓶或烧杯中加入20 mL混合酸，再用电热板加热煮沸消化。20 ml混合酸带来环境 污染和资源浪费；消化是否完成以观察消化过程中产生的浓白烟来判定，由于没有一个明 确的指标，大多数情况下都是凭借经验做出判断，使判定结果很难精确，受主观因素影响很 大；硒在上述消化过程中很容易挥发损失，使测定结果难于保证；由于样品消化液本底的 干扰，指示剂对颜色变化很难判断，同时指示剂的加入也会带来干扰的可能。
[0015] 本方法将上述溶液无损转移到容量瓶中，并用纯水定容至500 mL，取出2. 5 mL加 入至锥形瓶中，再加入30~40mL的水，用氨水溶液和3 mol/L盐酸调节pH至1.7~1.9,上述 国标用氨水或盐酸调至淡红橙色（PHI. 5~2. 0)，并用甲酚红溶液来做指示剂，由于样品消化 液本底的干扰，指示剂对颜色变化很难判断，同时指示剂的加入也会带来干扰的可能。
[0016] 用0. 1 mol/L盐酸溶液稀释定容至100 mL，接着加入3 mL EDTA混合液摇匀，后 加入3 mL DAN溶液，摇匀，置于沸水中保持5 min。取出冷却至室温(一般为25摄氏度)，全 部转移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL环己烧振荡2. 0 min，静置分层后，于焚光分光光 度计上