一种固相萃取柱及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种固相萃取柱及其应用。
【背景技术】
[0002] A型单端孢霉烯族类毒素是一类由镰刀菌产生的真菌毒素，主要包括T-2毒素 (T-2)、HT2毒素（HT2)、新茄病镰刀菌烯醇（NE0)及二乙酰薦草镰刀菌烯醇（DAS)四种。这 四种毒素能够广泛污染玉米、小麦、大米等农作物，人畜误食污染严重的该类谷物后，可引 起心肌受损、胃肠上皮动膜出血、皮肤组织坏死、造血组织破坏和免疫抑制、神经系统紊乱、 心血管系统破坏等，严重的可引起死亡。
[0003] 现有的关于A型单端孢霉系族类毒素的净化方法主要为固相萃取柱净化，商业化 的固相萃取柱主要为HLB柱、免疫亲和柱等。但是，商品化的免疫亲和柱价格非常昂贵，即 使最为便宜的HLB柱，单支价格也要20元左右，而国标GBT 23501-2009中前处理采用的免 疫亲和柱，单支价格甚至达到80-100元。而且，商品化的固相萃取柱小柱，大多针对某一种 毒素或者某一种基质的净化，无法实现多种基质多种毒素同时净化的目的。目前，尚缺乏一 种价格低廉的固相萃取柱，可以有效的用来对玉米、小麦和大米中四种A型单端孢霉烯族 类毒素同时富集净化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的首先在于提供一种固相萃取柱，其填料为多壁碳纳米管；
[0005] 具体的说，该固相萃取柱包含上筛板、多壁碳纳米管填料和下筛板；
[0006]其中所用的多壁碳纳米管可为多种型号的，如8nm i. d.，10-30 ym length, 500m2/ g ;填充量为l〇-l〇〇mg ;所采用的填充柱体积为0. l-1000mL，内径为0. l-50cm ;填料上下两 端各有一块筛板，筛板厚度为
[0007] 本发明还提供了上述固相萃取柱的应用，其可用于同时对农作物中四种A型单端 孢霉烯族类毒素进行富集净化。
[0008] 本发明还提供了一种应用上述固相萃取柱对农作物中四种A型单端孢霉烯族类 毒素进行富集净化的方法，该方法包括如下步骤：
[0009] 进行样品提取液上样；
[0010] 第一步淋洗液淋洗；
[0011] 第二步淋洗液淋洗；
[0012] 洗脱液洗脱后即获得含有四种A型单端孢霉烯族类毒素的样品溶液。
[0013] 具体的说，
[0014] (1)制备样品提取液，即上样液：取玉米、小麦、大米样品，用有机溶剂水溶液超声 提取lh，提取液氮气吹干，再加入有机溶剂水溶液，涡旋30s，超声lmin，然后加入水，涡旋 30s，超声lmin后，得到上样液；
[0015] 其中所述的有机溶剂水溶液为甲醇水溶液、乙腈水溶液或者其它有机溶剂与水的 混合液，其中有机溶剂的体积百分比例为0. 001-20%，上样体积为1-lOOmL。
[0016] ⑵第一步淋洗液为正己烷或类似的弱极性有机溶剂，淋洗体积为l-100mL。
[0017] (3)第二步淋洗液为甲醇水溶液、乙腈水溶液或者其它有机溶剂水混合液，其中淋 洗液中有机溶剂的体积百分比例为〇. 001-20%，淋洗液体积为l-100mL。
[0018] (4)洗脱液为含（0? 1-5% )甲酸的甲醇（v/v)或者含（0? 1-5% )甲酸的乙腈（v/ v)或者含（〇. 1-5% )甲酸的其它有机溶剂（v/v)，洗脱液体积为l-100mL。整个实验操作 中，液体流速（包括上样液、淋洗液、洗脱液）不超过2mL/min。
[0019] 本发明的有益效果主要体现在：
[0020] (1)首次采用具有大比表面积的纳米材料作为填充材料，用于对真菌毒素的净化。 多壁碳纳米管对目标物具有很好的吸附性能，能够显著除去干扰杂质；
[0021] (2)遵循通用的上样、淋洗、洗脱步骤，属于常规使用方法，一般实验人员简单培训 即可使用，不需要特殊仪器设备，实用性强；实验流程较快，整个过程不超过1小时；
[0022] (3)多壁碳纳米管可以商品化得到，价格为lg = 20元，若以单支固相萃取柱的填 充量为50mg，那单支固相萃取柱的价格不超过5元，与现有的商品化固相柱相比，在保证净 化效果的同时，大大节省了成本；
[0023] (4)本发明的净化方法稳定、成熟，能够适用于玉米、大米、小麦等多种谷物中的四 种A型单端孢霉烯族类毒素同时富集净化，适用范围广，净化效果好。
【附图说明】
[0024]图1为发明实例中基于多壁碳纳米管填充材料的固相萃取小柱结构图。
[0025] 其中，1、填充柱；2、上筛板；3、填料；4、下筛板
[0026] 图2为发明实例中玉米、小麦、大米通过固相萃取柱净化与不净化表观特征的比 较。
[0027]图3为净化后的基质的色谱图。（A)大米⑶小麦（C)玉米
[0028]图4为净化后的基质标样的色谱图（标准品浓度Ing/mL)。（A)大米⑶小麦（C) 玉米
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0030] 实施例一制备固相萃取柱
[0031] 固相萃取柱的结构示意图见图1，主要由四部分组成：填充柱（容积为3mL)、上筛 板（厚度2mm)、下筛板（厚度2mm)及填料（50mg，高约5cm);
[0032] 填料为多壁碳纳米管（南京先丰纳米材料科技有限公司，型号为8nm i. d.,10-30 ym length, 500m2/g)〇
[0033] 实施例二
[0034] 应用实施例一的固相萃取柱进行四种A型单端孢霉系族类毒素的富集净化
[0035] 第一步，制备上样液：分别称取2g玉米、小麦、大米样品（上海市售随机样本），用 10mL乙腈/水溶液（84/16, v/v)超声提取lh，取5mL提取液氮气吹至近干，再加入0. 5mL 的乙腈/水溶液（20/80, v/v)，涡旋30s，超声lmin，然后加入4. 5mL水，涡旋30s，超声lmin 后，准备过柱净化；
[0036] 第二步，上样：将上述提取液加入净化柱中，调节真空度，使其过柱流速大约为 2mL/min，流出液弃去；
[0037] 第三步，淋洗：首先用5mL正己烷进行第一步淋洗，然后再用5mL的甲醇/水溶液 (5/95, v/v)进行第二步淋洗，淋洗液的过柱流速大约为2mL/min，过柱后的流出液弃去；
[0038] 第四步，洗脱：用5mL含1% (体积比）甲酸的甲醇溶液洗脱，负压抽干，收集洗脱 液，洗脱液氮气吹干，用lmL的乙腈/含5mM醋酸铵的水溶液（20/80, v/v)定容，过膜后进 LC-MS/MS 分析；
[0039] 第五步，检测：采用高效液相色谱串联质谱仪（UHPLC-XEVO TQ-S，waters公司， 美国）对样品进行检测。液相条件为：流动相为（A)含5%醋酸铵的水溶液（m/v) ; (B)甲 醇。线性梯度洗脱：初始：40%B，0-4min 90%B，4-4.5min 90%8,4.5-4.81^1140%8，平 衡2.2min，总运行时间为7min。进样体积为5yL。质谱条件为：离子源温度：150°C;脱溶 剂气温度：500°C ;锥孔气和脱溶剂气流量分别是30和1000L/h。采用MRM法检测，具体各 个毒素的检测参数见表1。
[0041]3表示定量离子。
[0042]结果：
[0043] (1)表观特征：如图2所示：从表观上看，经过多壁碳纳米管填充固相萃取柱净化 后的含有四种A型单端孢霉烯族类毒素的样品溶液（玉米、小麦、大米）与未净化样品液相 比，明显澄清透明，且经过净化的样品液，完全可以除去色素等大多数干扰杂质，可以达到 净化的目的；
[0044] (2)样品净化后基质干扰情况：由图3可以看出经过净化后的样品基本不存在任 何目标物的干扰杂质，无干扰色谱峰的存在；
[0045] (3)样品净化后的基质加标情况：将净化后的样品基质加入四种标准品，配成 Ing/mL的基质加标溶液，由图4可以看出，Ing/mL的基质标液中即可出较好的色谱峰，未发 现基质干扰；
[0046] (4)方法的回收率验证：采用基质加标法对方法的回收率进行考察，分别称取 2g玉米、小麦、大米样品，添加低、中、高三个浓度水平（1 y g/kg, 50 y g/kg和400 y g/ kg)的四种真菌毒素标准品，以原样本为对照组，各平行三份实验。样品按照上述步骤净 化后检测，回收率结果为：玉米样品：73. 4-91. 4% ;小麦样品：75. 2-113. 7% ;大米样品： 74. 6-96. 3% ；
[0047] (5)方法的精密度验证：在同一天内，平行5份样品进行试验，纯化检测后得到日 内精密度：1. 2-14. 0% ;连续3天，每天平行5份样品进行试验，检测计算后得到日间精密 度：3. 2-17. 1%〇
[0048] 综上可见，本发明的固相萃取柱，可以有效的对玉米、小麦、大米等多种谷物中的A 型单端孢霉系族类毒素富集净化，具有明显的净化效果，单支固相萃取柱的制备成本不超 过5元，经净化后的各种样品基质，灵敏度均低于Ing/mL，明显高于现有的分析方法，并且 回收率高，精密度好。与现有的商品化固相萃取柱相比，在保证甚至优于其准确度和重现 性的前提下，极大的节省了成本，显著的降低了基质干扰，明显提高了方法灵敏度。
[0049] 本发明的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本发明方案中心的修改 都属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种固相萃取柱，其特征在于其填料为多壁碳纳米管。2. 根据权利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于该固相萃取柱包含上筛板、多壁碳 纳米管填料和下筛板。3. 权利要求1或2所述固相萃取柱的应用，其可用于同时对农作物中四种A型单端孢 霉烯族类毒素进行富集净化。4. 一种应用权利要求1或2所述固相萃取柱对农作物中四种A型单端孢霉烯族类毒素 进行富集净化的方法，该方法包括如下步骤： 进行样品提取液上样； 第一步淋洗液淋洗； 第二步淋洗液淋洗； 洗脱液洗脱后即获得含有四种A型单端孢霉烯族类毒素的样品溶液。
【专利摘要】本发明提供了一种固相萃取柱，其填料为多壁碳纳米管。本发明的固相萃取柱可用于同时对玉米、大米、小麦等农作物中四种A型单端孢霉烯族类毒素进行富集净化。本发明的固相萃取柱制备简单，操作容易，对农作物中四种A型单端孢霉烯族类毒素的富集净化效果好。
【IPC分类】G01N30/60, G01N30/08
【公开号】CN104931627
【申请号】CN201510253906
【发明人】韩铮, 赵志辉, 董茂锋, 宋卫国, 聂冬霞, 司文帅
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月18日