检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体而言，涉及一种用于检测动物源食品中残留药物 的液质数据库及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 动物源食品在国际农产品贸易中占相当比重，针对动物源食品中药物残留的法规 限制越来越严格，以日本06年5月实施的"肯定列表"制度为例，其对236种兽药和饲料添 加剂制定了具体限量标准，而在国内食品安全领域，从早期的"氯霉素、硝基呋喃"到后来的 "孔雀石绿、瘦肉精"，因药物残留导致的食品安全事件频发凸显我国食品安全监管控制体 系技术支撑能力不足，迫切需要建立多种类残留快速筛选方法。目前，针对动物源食品中药 物残留检测技术和方法已由单残留分析发展到了单种类多残留分析，03年以来，以物质种 类界分的多残留检测标准占据了残留分析国家和行业标准的70%以上。同时期，质谱分析 已经成为多残留检测的主要技术手段，以欧盟2002/657/EC法规为蓝本的技术指标规则也 为国际上所承认和接受。随着残留分析技术的发展，多种类残留分析在信息量、检测效率等 多方面具有优势使其成为研发热点，且质谱设备领域如Q-TOF，Q-Trap等串联质谱仪的实 用化，以高级质谱技术为基础的谱库比对分析逐渐成熟也为多种类残留快速分析提供了技 术可能。然而，无论是在方法开发、验证和标准化还是在法规完善等方面，同时检测多种类 残留都存在较多困难：
[0003] (1)不同种类兽药物化性质差别很大，极性覆盖范围宽，在不同基质中残留形态不 一，个别兽药尚需衍生化方能有效检测，因此在通用前处理方法和色谱一次进样分析上难 以实现有效突破；
[0004] (2)法规对不同兽药（禁用药物和限用药物）的限量要求和使用规定不一，多种类 残留检测验证规则尚未完善；
[0005] (3)方法开发需要的空白基质难以获得，混合标准溶液制备困难；
[0006] (4)仪器的分析能力。在构建液质谱库方面，尽管有商业化谱库如AB公司法医毒 物数据库（1250种目标分析物）、兽药数据库（139种目标分析物）；Freiburg大学医院的 小分子药物数据库等，但存在如下应用局限：
[0007] 1)仅有MS/MS数据，无色谱体系信息特征；
[0008] 2)无在线信息特征；
[0009] 3)无统一前处理方法和仪器分析相偶联；
[0010] 4)缺乏基质标准数据。
[0011] 因此，在现有条件下，很难有效实现基于液质谱库技术的多种类残留快速筛查分 析。
【发明内容】
[0012] 鉴于目前国内外在动物源食品多种类残留药物分析中存在的样品通用性前处理、 仪器快速分析和筛选方法验证等技术难点。本发明以建立动物源食品中高风险药物多种 类残留快速筛选检测体系为目的，通过采用多溶剂体系分段组合提取、建立样品高通量通 用性前处理技术、综合优化色谱体系实现多目标分析物宽极性范围液相色谱有效保留与分 离、并通过构建涵盖色谱-质谱多维信息的液相色谱-质谱/质谱数据库及依据法规要求 和检测实践进行筛选方法验证等关键技术内容的研发，突破多种类残留分析技术难关，建 立一个以多种类残留通用性前处理技术、快速分离体系和液质谱库为技术特征的开放性快 速分析平台和有效筛查检测技术体系。
[0013] 本发明针对12种限量值在1.0 yg/kg以下高风险残留药物（A类残留物质）作为 检测目标，该组药物分别为，
[0014] (1)留体激素类化合物：睾酮（T)、泼尼松龙（PNSL)、倍他米松（BTS)、地塞米松 (DTS)；
[0015](2)硝基咪唑类药物及其代谢产物：甲硝哒唑（MNZ)、咯硝哒唑（RNZ)、二甲硝咪唑 (DMZ)；
[0016] (3)Beta_受体激动剂类物质：克伦特罗（CLB)、妥布特罗（TUL)、西马特罗（CIM);
[0017] (4)染料类物质：结晶紫（CV)和隐色结晶紫（LCV);
[0018] 本发明首先涉及一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质 谱库的构建方法，所述的动物源食品为动物肌肉类食品、奶类食品，具体包括如下步骤，
[0019] (1)标准工作溶液的制备；
[0020] 留体激素类化合物、硝基咪唑类药物及其代谢产物、Beta-受体激动剂类物质：采 用乙腈分类配制其混合标准储备溶液（〇.〇lg/L);
[0021] 染料类等物质采用甲醇分类配制其混合标准储备溶液（0. 〇lg/L);
[0022] 混合和标准工作溶液（0. lmg/L)，分别移取睾酮、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、 甲硝挫、咯硝哒挫、二甲硝咪挫、克伦特罗、妥布特罗、西马特罗、结晶紫和隐色结晶紫标准 储备溶液适量，用乙腈配制浓度为〇. lmg/L的混合标准溶液；
[0023] (2)分析前处理，采用快速酶解（释放结合态残留）+快速固相萃取（SPE)的提取 净化技术进行待测样本分析前处理工作，具体的提取净化过程如下：
[0024] 1)提取：称取均质样品5g，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸铵缓冲液 (0. 2mol/L，pH 5. 2)15mL，0-葡糖苷酸/硫酸酯酶50yL，涡旋混勾，50°C水浴振荡2h，放 冷至室温，于〇°C，15000rpm离心5min，转移上清至另一干净离心管中，用NaOH溶液（5mol/ L)调节pH至9. 0,再加入乙酸乙醋20mL,氯化钠6g，振荡祸旋5min，于0°C，15000rpm离心 5min，取上层有机相35°C旋蒸至近干，氮气吹干，残渣使用5mL 0. lmol/L盐酸溶液溶解，超 声lmin，留待上柱净化；
[0025] 2)净化：MCX柱（Waters Oasis MCX SPE小柱）安装于固相萃取装置上（该装置在 实用新型专利CN201020014620. X中有详细记载），依次使用甲醇3mL，水3mL，3mL 0. lmol/ L盐酸溶液活化。将提取溶液加载在固相萃取柱上，在重力作用下流出，依次使用3mL水， 3mL甲醇和5mL正己烧淋洗小柱，抽干2min，加入6mL洗脱液（乙酸乙醋50mL，甲醇45mL， 氨水5mL，混匀）洗脱。洗脱液35°C下氮气流吹干，使用样品溶解液（量取0.1%甲酸乙腈 (V/V)溶液5mL，与甲酸铵（5mmol/L)-甲酸（0. 1 % )-水溶液95mL混匀）0. 5mL溶解残渣， 超声lmin，过0. 22 yM微孔滤膜；所述的固相萃取装置整合试剂架、氮吹仪的功能且操作压 力相对均匀，其由试剂架、操作台、8个玻璃仓、8个梨形瓶和1个自动吸气装置组成，可实现 目标分析物的快速SPE过程。
[0026] (3) -次性进样色谱分析
[0027] 使用色谱柱为Kinetex C18柱，采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸 盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系；
[0028]具体条件为：色谱柱：KinetexC18, 2. 6ym，2. ImmX 100mmi. d.;
[0029] 流速：0? 2mL/min ；
[0030] 进样量：10yL;
[0031]柱温：3(TC;
[0032] 梯度洗脱程序：(A :0. 1 %甲酸-乙腈溶液；B :甲酸铵（5mmol/L)-甲酸 (0? 1% )-水溶液）
[0033] 0 ~2min :5%A ;
[0034] ~8min:20% A ;
[0035] ~15min :95% A;
[0036] ~16min :100%A ;
[0037] ~19min :100% A ;
[0038] 20min：5%A ；
[0039] (4)构建液质谱库
[0040] 采用四级杆/离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测（sMRM)-信息 依赖性采集（IDA)-增强子离子扫描（EPI);
[0041] 质谱参数确定过程如下：使用初始流动相按目标分析物类别稀释混标储备溶液至 浓度为〇. 2mg/L，然后使用恒流注射泵以5y L/min的流速注入质谱离子源中进行参数优化，
[0042] 分别使用QlMS、QlMultiple Ions、Product Ion、MRM等扫描模式确定目标分析物 的母离子，子离子，并使用Ramp功能优化并确定解聚电压（DP)、碰撞室入口电压（EP)、碰撞 能量（CE)、碰撞室出口电压（CXP)等化合物参数；
[0043]质谱条件（API 4000 和 API 4000Q-TRAP):
[0044] a)离子源：电喷雾离子源；
[0045] b)扫描方式：正离子扫描；
[0046] c)检测方式：sMRM-IDA-EPI
[0047] d)电喷雾电压：5500V ;
[0048] e)雾化气压力：40psi ;
[0049] f)气帘气压力：30psi ;
[0050] g)辅助气压力：45psi ;
[0051] h)离子源温度：475°C ;
[0052] i) sMRM参数设置：MRM检测窗口设为60s，目标物扫描时间设为1. 4s;
[0053] j) IDA规则：响应阈值：3000cps ;动态背景扣除；最强离子选择为1到3 ;
[0054]k)增强子离子扫描（EPI)参数设置：扫描质量数范围为70~lOOODa ;扫描速度为 10000Da/S ;扫描累