一种分子印迹试纸条及其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及一种盐酸克伦特罗分子印迹试纸条及其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]瘦肉精是具有肾上腺素受体激动作用的一类药物的统称，又称β 2-兴奋剂，具有促进肌肉生长、提高瘦肉率的作用，曾作为生长添加剂被广泛关注，但β 2-受体激动剂在动物体内有一定的残留时间，通过食物链进入人体后会使一些易感人群产生明显的中毒症状，危害人类健康。盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)是瘦肉精中的一种，它能够明显促进动物生长，并增加瘦肉率，因而被一些不法分子使用在动物生产中用来增加瘦肉率。研宄表明，残留在动物体内的盐酸克伦特罗被人使用后会毒害肾脏、肝脏等器官，会出现头痛不适、恶心呕吐、肌肉颤抖、心率加快、头晕目眩等症状，甚至会导致死亡，因此，我国严禁在动物生产中使用盐酸克伦特罗。现有检测盐酸克伦特罗的方法均需要复杂的样品处理过程和分析步骤，需要大型仪器及经过专门训练的专业人员操作，时间长、成本高，远不能满足在线检测的要求。
[0003]试纸法由于具有携带方便、操作简单、测定速度快等特点，在食品、水质、医疗卫生等领域有较多应用。如2001年河南省农科院动物免疫学重点实验室与河南百奥生物工程有限公司于成功研发了“瘦肉精”专用快速检测试纸技术并投放市场，使用该试纸可在60秒内快速直观地检测出肉品中是否含有超过安全标准的“瘦肉精”，该试纸检测技术以单克隆抗体为基础设计而成，检测时胶体金标记的“瘦肉精”单抗被检测线上固定化的“瘦肉精”人工结合抗原捕获，形成一条棕红色的检测线，过量的胶体金标记单抗继续涌动被对照线上固定化的羊抗鼠抗体捕获形成一条棕红色的对照线，如果样品中含有“瘦肉精”，它将与固定化在检测线上的人工抗原竞争有限的胶体金标记单抗。申请号为200810219632.1的中国专利，公开了一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法，该纸包括支撑固定粘衬层，在支撑固定粘衬层上依次有样品吸附层、结合垫、微孔虹吸反应层和吸水材料层，在结合垫上有示踪粒子标记的盐酸克伦特罗抗体和示踪粒子标记的抗体A，当样品中含有5纳克以上的盐酸克伦特罗时，检测区出现两条线，当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，检测区出现一条线，该试纸具有与夹心法等同的检测模式及判读方式且成本低，该检测方法简便快捷，操作简单。但上述方法在使用中存在以下问题:超过判读时间容易出现假阴性、假阳性结果，质控线有时不显现，检测线颜色模糊不清，漏检率偏高等，因此，寻找一种快捷、方便、高选择、高灵敏的检测盐酸克伦特罗的试纸方法具有重要意义。
[0004]分子印迹是近年来兴起的分子特异性识别技术，具有对模板分子在功能基团、分子尺寸、空间结构具有记忆功能的结合位点，可以根据预定的选择性和高度识别性能进行分子识别，在印迹中形成的特异性识别位点能和被分析物选择性作用，并且这种作用是可逆的，这种合成的材料机械强度和化学稳定性好，能在极端环境中使用。现已有将分子印迹技术结合试纸法制备得到的分子印迹试纸条，不仅具备了分子印迹特异识别能力，且具有试纸条检测速度快、携带方便的特点，但是目前尚未有制备盐酸克伦特罗分子印迹试纸条及其检测方法的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有的经典盐酸克伦特罗的检测方法前处理复杂、时间长、成本高，现有的试纸法易出现假阴性假阳性结果、漏检率高等现状，提供了一种盐酸克伦特罗分子印迹试纸条及其制备方法及应用，该试纸条制备方法简单、成本低、特异性强、稳定性好。本发明盐酸克伦特罗分子印迹试纸条可用于盐酸克伦特罗的在线痕量检测。
[0006]本发明的技术方案为:
[0007]—种分子印迹试纸条，包括基底和反应区，所述反应区为覆盖基底镂空区域的对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜；
[0008]所述对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜的制备方法为:将硝酸纤维素膜放入盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液中浸泡30分钟，取出后置40°C烘箱内烘干，用15-40%乙醇洗涤硝酸纤维素膜，再用水洗涤硝酸纤维素膜，晾干，即得；
[0009]所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液是以盐酸克伦特罗为模板分子，以α -甲基丙烯酸为功能单体，以氢键形式进行相互作用，加入交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺、弓丨发剂过硫酸铵发生自由基共聚，得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液；所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为117-274:1-300:30-90。
[0010]以上所述分子印迹试纸条，所述反应区可位于基底的任一位置，为方便操作，优选位于基底的一端。
[0011]以上所述分子印迹试纸条，所述基底的材料可为不影响试验的任何材料，优选为塑料或相片纸。
[0012]一种以上所述的分子印迹试纸条的制备方法，包括以下步骤:
[0013]1.盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液的制备:
[0014]a.配制浓度为3X 1(Γ3-3Χ l(T5mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；
[0015]b.将3-7“1^-甲基丙烯酸加入到10-301^浓度为3\1(^-3\1011101/1盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理5-15分钟，再加入0.0014-0.0042g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理10-30分钟，静置过夜，得混合液；
[0016]C.将80-120 μ L浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤b得到的混合液中，超声处理10-20分钟，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。
[0017]2.对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜的制备:将硝酸纤维素膜放入盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液中浸泡30分钟，取出后置40°C烘箱内烘干，用15-40%乙醇洗涤硝酸纤维素膜，再用水洗涤硝酸纤维素膜，晾干，剪裁好；
[0018]3.剪裁基底，在基底内剪裁出一镂空区域，在镂空区域的基底周围涂上胶水或粘上双面胶，将上述步骤2中剪裁好的对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜粘在基底上，再盖压一个具有相同镂空区域的基底，即得。
[0019]以上所述分子印迹试纸条的制备方法，所述步骤3中基底的大小优选为8cmX 1cm，所述镂空区域的大小优选为4cmX0.8cm。
[0020]以上所述的分子印迹试纸条的应用，用于待测样品中盐酸克伦特罗的定性、半定量或定量检测。所述待测样品可为任何可能含有盐酸克伦特罗物质，如饲料、尿液等，通过酸、碱或酶解等方法进行预处理，制备成待测样品溶液。
[0021]以上所述的分子印迹试纸条，为使用方便快捷，可制成试剂盒配套使用，该试剂盒包括分子印迹试纸条、活性为200-400ug/mL的葡萄糖氧化酶标记盐酸克伦特罗溶液、0.lg/mL葡萄糖溶液、3X 10_4mol/L署红Y溶液和标准比色卡。
[0022]以上所述试剂盒，还包括紫光笔。
[0023]本发明利用化学法聚合制备得到盐酸克伦特罗的分子印迹聚合物，将其制备成分子印迹试纸条，用25%乙醇洗脱模板分子盐酸克伦特罗，留下对盐酸克伦特罗具有特异性识别能力的印迹孔穴。印迹膜表面的孔穴能够同时识别盐酸克伦特罗及具有相同结构的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗。将洗脱模板分子的试纸条在高浓度的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗中孵化后，印迹孔穴被葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗占据。随后竞争反应是在样品中的盐酸克伦特罗和印迹膜上的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗之间进行，盐酸克伦特罗能够竞争取代葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗重新占据孔穴。随着样品中盐酸克伦特罗分子浓度的增加，印迹膜上被竞争取代的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗就越多，即残留在印迹膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印迹膜表面的葡萄糖氧化酶能够与底液中的葡萄糖发生酶解反应产生过氧化氢，过氧化氢进一步氧化分解底液中的署红Y使其褪色，因此，通过检测试纸条的荧光强度，能对样品中的盐酸克伦特罗进行快速定性、半定量或定量分析。
[0024]本发明的有益效果是:
[0025]1.本发明的盐酸克伦特罗分子印迹试纸条，适用于食物或排泄物等样品中盐酸克伦特罗的快速定性、半定量或定量检测。
[0026]2.本发明试纸条制备方法简单、成本低、特异性强、稳定性好。
[0027]3.本发明盐酸克伦特罗分子印迹试纸条用于检测盐酸克伦特罗，具有简单、快速、成本低、准确可靠等优点，避免出现假阴性假阳性结果、漏检等情况。
[0028]4.将本发明试纸条制成试剂盒，共同出售，可使检测过程更加方便快捷，实现在线痕量检测。
【附图说明】
[0029]图1为本发明实施例1-3盐酸克伦特罗分子印迹试纸条的制备方法示意图。
[0030]图中各编号名称分别为:1.基底，2.镂空区域，3.涂胶水或粘双面胶区域，4.对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜，5.具有相同镂空区域的基底，6.反应区
[0031]图2为本发明的各浓度盐酸克伦特罗标准溶液的荧光图
[0032]图中各编号试纸条所用的溶液分别为:1.浓度为3X10_4mol/L的盐酸克伦特罗标准溶液，2.浓度为3X10_5mol/L的盐酸克伦特罗标准溶液，3.浓度为3 X 10_6mol/L的盐酸克伦特罗标准溶液，4.浓度为3Xl(T7mol/L的盐酸克伦特罗标准溶液，5.浓度为3 X 10_8mol/L的盐酸克伦特罗标准溶液，6.空白溶液
[0033]图3为本发明实施例4试纸条的荧光图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图及【具体实施方式】对本发明作进一步描述，但不限制本发明的使用范围和应用范围。
[0035]一、盐酸克伦特罗分子印迹试纸条的制备方法
[0036]实施例1
[0037]一种分子印迹试纸条的制备方法，包括以下步骤:
[0038]1.盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液的制备:
[0039]a.配制浓度为3 X 10_4mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；
[0040]b.将5 μ L α -甲基丙烯酸加入到20mL浓度为3 X 10_4mol/L盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理10分钟，再加入0.0028g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理20分钟，静置过夜，得混合液(所述盐酸克伦特罗、α -甲基丙烯酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺加入量的摩尔比为 9.78:1:3.03)；
[0041 ] c.将100 μ L浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤2得到的混合液中，超声处理15分钟引发聚合反应，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物；
[0042]2.对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜的制备:将硝酸纤维素膜放入盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液中浸泡30分钟，取出后置40°C烘箱内烘干，用25%乙醇洗涤硝酸纤维素膜，再用水洗涤硝酸纤维素膜，晾干，剪裁好；
[0043]3.剪裁大小为8cmX Icm基底，在基底内剪裁出一大小为4c